L'aspect le plus étudié de la biocompatibilité des matériaux composites dentaires est leur cytotoxicité 3D CLSM laps de temps imagerie combiné avec le signal fluorescent quantification permet une évaluation sensible du destin cellulaire au cours du temps. En utilisant cette méthode pourrait être un outil efficace pour évaluer la cytocompatibilité des composites dentaires.
Il est généralement admis que l'interaction in vitro de la matière dans la cellule est un critère utile pour l'évaluation de la biocompatibilité d'un matériau dentaire. L'objectif de cette étude était d'utiliser 3D CLSM laps de temps imagerie confocale pour évaluer la biocompatibilité in vitro des composites dentaires. Cette méthode fournit une indication précise et sensible de taux de cellules viables en contact avec des extraits de composites dentaires. L'ELS supplémentaire faible retrait, une composite dentaire utilisé pour la restauration directe, a été pris comme exemple. Évaluation in vitro a été réalisée sur des cellules en culture primaire de fibroblastes gingivaux humains en utilisant en direct coloration / Dead. Les images ont été obtenues avec le système biologique confocal inversé FV10i et analysés avec le logiciel FV10 3,1-ASW. L'analyse des images a montré une très légère cytotoxicité en présence du composite testé après 5 heures de laps de temps. Une légère diminution de la viabilité cellulaire a été montré en contact avec le composite extraits compar testéed à contrôler les cellules. Les résultats ont mis en évidence l'utilisation de 3D CLSM laps de temps d'imagerie comme une méthode sensible pour évaluer qualitativement et quantitativement le comportement de la biocompatibilité des matériaux composites dentaires.
L'une des principales normes citées dans les recommandations de l'ISO pour définir la biocompatibilité est l'absence de toxicité matière de cellules. Composites dentaires à base de résine peuvent libérer des composants de la matrice résineuse, qui pourraient être d'abord dû à la polymérisation partielle, et / ou plus tard en raison de processus de dégradation au fil du temps 1-4. Ces composants libérés entrer en contact avec les tissus buccaux et peuvent avoir différents inconvénients comme des réactions urticariennes et des muqueuses 5, le développement de l'allergie et des réactions d'hypersensibilité chez les patients 6, les modifications de fibroblastes gingivaux morphologie et la réduction de collagène de type I protéines 7, immunosuppression ou immuno-stimulation sur mitogène axées sur l prolifération des lymphocytes T purifiés et les cellules de la rate 8 et dommages à l'ADN dans les fibroblastes gingivaux humains primaires, ce qui souligne leur potentiel génotoxique 9. De nombreux paramètres peuvent influer sur la toxicité composite dentaire comme l'ombre de la che de la dentine, la photopolymérisation, la composition chimique du monomère de la résine, la charge et le degré de conversion de 10 13. Depuis potentiel toxique in vitro de matériaux peut prédire dans des situations in vivo et pourrait être comparé à des situations cliniques de l'étude de certains paramètres pertinents. La cytotoxicité des composites dentaires et de leurs composants ont été largement évaluée en utilisant des systèmes de culture cellulaire 14- 16.
Ces systèmes in vitro ont été élaborés pour évaluer les composites dentaires biocompatibilité en terme de: la croissance cellulaire et l'apoptose cellulaire en utilisant THP-1monocytes comme les cellules 17, la cytotoxicité dans les fibroblastes gingivaux humains 18, le potentiel inflammatoire dans HaCaT kératinocytes comme les cellules 2, fonctionnalité des cellules odontoblast- comme MDPC-23 cellules 19, la réduction des niveaux d'ARN totaux, et une augmentation significative de l'induction de l'apoptose sur gingival kératinocytes humains 20 etlésions de l'ADN sur la gencive et pulpe fibroblastes cellules 21.
Différentes méthodes sont proposées pour étudier la biocompatibilité des composites dentaires. Les dosages colorimétriques, qui impliquent des colorants spécifiques et des mesures d'adsorption de lumière, restent le plus communément utilisé, en raison de leur relative simplicité et son faible coût 22- 26. analyse de microscopie par contraste lumineux consomme souvent plus de temps et entraîne des coûts plus élevés. Cependant, ces techniques de microscopie présentent certains avantages importants. L'observation de la structure cellulaire donne des informations étendues sur les effets toxiques expérimentés, fournissant ainsi des données plus pertinentes et sensibles. En particulier, l'introduction de la microscopie confocale 27 a permis l'observation de structures biologiques à l'amélioration de la résolution axiale par rapport à l'ensemble du champ des microscopes traditionnels de fluorescence d'imagerie. Par conséquent, l'imagerie confocale est devenu un puissant outil d'enquête dans différents domaines de larecherches médicales et scientifiques. Contrairement aux techniques de microscopie électronique, microscopie confocale à balayage offre la possibilité de visualiser des composants distincts de cellules par incorporation de marqueurs fluorescents spécifiques. La plupart de ces traceurs spécifiques sont stables dans un environnement aqueux, sensiblement mesurable, peu coûteuse et non toxique 28, ce qui permet leur utilisation en clinique ainsi que des études de recherche en laboratoire. En outre, le séchage et la fixation de l'échantillon utilisé pour l'analyse par microscopie électronique conventionnelle ne sont pas nécessaires pour l'imagerie confocale laps de temps, donc acquisition en fonction du temps est également possible sur des échantillons. Par rapport à l'imagerie bidimensionnelle, le principe de l'imagerie confocale permet une visualisation sous la surface de l'échantillon et la reconstruction de la structure tridimensionnelle à partir des différentes images de profondeur obtenues; détails qui se traduisent par, plus précises et plus structurels 29, 30 L'étude de la vidéo. présent est un exemple de l'utilisation des trois dimensions Time-Lapse Confocal à balayage laser (CLSM 3D) associé à un étiquetage Vivant / Mort fluorescent et le signal quantification comme une méthode innovante. La technique présentée dans ce document a l'avantage de permettre l'évaluation sensible et imagerie time-lapse de cellules vivantes sans modifier la structure de la cellule évalué. Aucun étapes de préparation sont nécessaires avant l'analyse confocale. Auparavant, la même coloration a été utilisé pour évaluer la viabilité de culture des carottes de 31 os spongieux mais sans confocale time-lapse suivant. De même, la même procédure time-lapse confocale a été utilisé pour évaluer l'activité érythromycine temps-kill dans les bactéries des boues activées en fonction de leur type Gram 32 en utilisant une bactérie spécifique Live / coloration mort. Ces méthodes ont été récemment utilisée et adapté pour comparer la toxicité des composites dentaires à base de monomères de méthacrylate 11.
le comportement des matériaux de biocompatibilité est le paramètre le plus préalable être évalués avant usage médical. Les normes internationales couvrent dispositifs médicaux ISO 10993 33 et plus particulièrement les matériaux dentaires ISO 7405 34. L'absence des effets toxiques sur les cellules environnantes est la norme clé dans l'évaluation de la biocompatibilité de ces matériaux. Cela est la raison pour laquelle l'essai de cytotoxicité a une telle importance dans l'évaluation de la biocompatibilité d'un matériau dentaire 35-37. L'ISO a suggéré des méthodes d'essai pourraient être basés sur l'activité métabolique ou à l'intégrité de la membrane. Critères d'évaluation retenus doivent respecter certaines conditions particulières de classement des effets néfastes induits par un matériau d'essai afin de réduire le temps et le coût des tests d'évaluation. La méthode actuelle de l'enquête (3D temps confocale lapse d'imagerie) est l'intégrité de la membrane à base. L'évaluation de la cytotoxicité par l'intermédiaire de ce point d'extrémité semble être un marqueur utile de la cellule de biocompatibilité avec des matériaux testés et il est également certifiée ISO extrémité. Les tests in vitro sont conçus pour déterminer comment un échantillon de matériau affecte un type cellulaire particulier. Le test colorimétrique au MTT a été décrite à l'origine par Mossman (1983) comme une méthode utile pour la mesure de la cytotoxicité in vitro et la prolifération cellulaire. Le test MTT est basé sur la conversion du sel de tétrazolium en cristaux de formazan par les cellules actives, qui détermine l'activité mitochondriale. Cela peut se traduire par le taux de viabilité 38. Gupta et ses collaborateurs ont indiqué que le test MTT est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer la cytotoxicité des résines composites. Succinique déshydrogénase et les réponses de la phosphatase alcaline ont également été utilisés dans le même but 39. Cependant, les cellules du devenir ne peuvent pas être suivi, depuis le test MTT nécessite tuer les cellules à chaque point de mesure du temps. Afin de suivre de plus près le comportement des cellules colorées dans la présente étude, direct observation de cellules vivantes a été réalisée grâce à laps de temps CLSM imagerie combinée avec une coloration de protocole court, l'analyse automatique d'images et fluorescent signal de quantification.
Composites dentaires sont en contact étroit avec les tissus buccaux, en particulier les cellules gingivales et la pulpe. Fibroblastes seraient la cible de composants libérés de ces composites de restauration 40 – 41. De plus, plusieurs études ont rapporté que les cellules immortalisées et les cellules primaires peuvent avoir différentes réponses cellulaires en contact avec des biomatériaux. Les cellules primaires ont été trouvés à être plus approprié pour évaluer les effets des biomatériaux 42. Ceci explique l'utilisation de cellules de fibroblastes gingivaux humains primaires comme modèle cellulaire pour l'évaluation de la cytotoxicité du composite dentaire testée dans la présente étude. Le potentiel de toxicité des substances rejetées par composite dentaire a été largement étudiée 43-44. Afin d'évaluer til cytotoxique potentiel des matériaux, deux cellules modèles de contact pourraient être effectuées. Dans le système de modèle de contact direct du matériau est placé directement avec les cellules cibles alors que dans le système à contact indirect, ciblent les cellules sont en contact avec élue de milieux biologiques. Dans les applications cliniques et les procédures de restauration, composite dentaire sont mis en contact indirect avec des tissus gingivaux. Pour cette raison, le protocole expérimental actuel est centré sur le système de contact indirect avec des fibroblastes gingivaux humains (cellules en présence des extraits composites testés). Comme indiqué précédemment par Dahl et collaborateurs, les réponses de cytotoxicité ont été classés comme sévère (<30%), modérée (30-60%), faible (60-90%) ou non-cytotoxique (> 90%) sur la base de l'activité par rapport à Les valeurs obtenues pour les contrôles 45. Par conséquent, selon ce classement et à la lumière des résultats obtenus (tableau 1), composite ELS supplémentaire faible retrait pourrait être classé comme very légèrement cytotoxique et présente un comportement comparable aux cellules témoins pendant toute la période laps de temps. Utilisation de la précision même méthode d'enquête, les résultats de cette étude pourraient être comparés à ceux d'une étude récemment publiée. L'ELS supplémentaire faible retrait composite démontré la biocompatibilité supérieure par rapport aux deux composites testés précédemment utilisés pour la même application clinique qui est la restauration directe 11. D'autres études sont encore nécessaires pour établir une comparaison plus complète.
Au moment de décider qui essai de cytotoxicité à approuver une évaluation spécifique de point final, il est important de comprendre les avantages et les limites de chaque méthode. Le but principal de l'imagerie confocale est de réaliser une architecture 3-D de cellules et d'organes. La technique est en mesure de révéler non seulement la surface de un spécimen, mais aussi son sous-sol. Le protocole décrit ici souligne l'utilisation de la 3D CLSM laps de temps imagerie confocale, comme une sensiProcédé tive pour évaluer le comportement de biocompatibilité in vitro d'un composite dentaire. Toutefois, afin d'éviter les limitations rencontrées dans ce travail, les postes de travail anti-vibrations pourraient être utilisés afin de permettre laps imagerie en temps plus stable et plus; la table peut isoler le système confocal utilisé contre les effets néfastes que les vibrations dans le laboratoire peuvent causer. En outre, les matériaux utilisés dans la cavité buccale devrait idéalement être sans danger pour les tissus gingivaux et ne doit pas contenir de substances qui pourraient causer une toxicité systémique. Conformément à la méthodologie utilisée et les résultats obtenus dans la présente étude, on peut conclure que le composé testé (ELS très basse de retrait) est non cytotoxique dans les conditions expérimentales présentes. Comme la méthode de CLSM peut sensibilité donner le taux initial de cellules viables, d'autres possibilités pourraient être envisagées pour évaluer plus de point final. En particulier, comme il a été récemment rapporté que des monomères composés affectent les cellules thrOugh espèces réactives de l'oxygène (ROS) 46- 48, une enquête plus approfondie est nécessaire pour évaluer les corrélations entre le cas échéant cytotoxicité réseaux et la production de ROS signalisation. Le futur protocole pourrait être conçu pour évaluer simultanément la production de ROS (H 2 O 2 et / ou O 2 – coloration) et le taux de cytotoxicité (Live de coloration / mort) à l'aide laps de temps CLSM imagerie.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |