Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve özgül<em> In vivo</em> Insan patolojisinde varyasyon yorumlamak için ölçülür. WT ve mutant insan mRNA ve morfolino (MO) antisens oligonükleotitler mikroenjeksiyon yoluyla geçici genetik manipülasyon insan gelişim bozuklukları bağlamında özel olarak hızlı bir şekilde, özellikle patojen tahlilinde mutasyonlar, ama bunlarla zebrabalıkları gelişen embriyonun izlenebilirlik koşum.
Burada, zebrabalıkları in vivo tamamlama kullanarak potansiyel klinik olarak anlamlı bir değişiklik nonsynonymous sorgulamak için testlerin geliştirilmesi için yöntemler sunar. Zebra balığı (Danio rerio) kendi deneysel tractability nedeniyle yararlı bir hayvan sistemi olan, embriyolar, basit görüntülenmesini sağlamak hızlı bir gelişme ex vivo geçmesi şeffaf, ve genetik olarak manipüle edilebilir Bu açıdan embriyogenezin analizinde önemli gelişmeler için izin 1,. moleküler süreçler ve morfogenetik sinyal. Birlikte ele alındığında, bu omurgalı modelin avantajları pediatrik hastalık gelişim kusurları modelleme için Zebra balığı son derece mükellef yapmak, ve bazı durumlarda, erişkin başlangıçlı bozukluklar. Zebrabalıkları genom insanlarda çok (orthologous ~% 70) o ile korunmuş olduğu için, bu zebrabalıkları insan hastalık durumları özetlemek mümkündür. Bu mutant insan m enjeksiyon yoluyla gerçekleştirilirNegatif baskın veya fonksiyon allel kazanç veya fonksiyon çeşitleri kaybı taklit genlerin bastırmak için morfolino (MO) antisens oligonükleotidler kullanımı ikna etmek için RNA. Şapkalı insan mRNA ile MO bağlı fenotipleri tamamlama sayesinde, bizim yaklaşım ölçülebilir, fizyolojik ilgili fenotip kurtarmak için mutant mRNA yeteneğine dayalı insan proteini dizisi mutasyonların zararlı etkisi yorumlanması sağlar. Insan hastalık allel modelleme MO ve / veya 1-4 hücreli aşamada insan mRNA ve yedi gün sonra döllenme (dpf) kadar fenotipleme ile Zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon yoluyla gerçekleşir. Aşağıdaki protokol gösterildiği gibi Bu genel strateji, hastalık fenotipleri geniş bir uzatılabilir. Biz morfogenetik sinyalizasyon, kraniofasial, kalp, damar bütünlüğü, böbrek fonksiyonları ve iskelet kası bozukluğu fenotipleri, hem de başkaları için kurulan modelleri sunuyoruz.
Bir genotip için öngörü klinik değerinin genetik bilgi ve atama fonksiyonel yorumlanması tıbbi genetik büyük bir sorun temsil eder ve genom dizileme ve hızlandırılması teknik ve ekonomik fizibilite ile giderek daha dokunaklı hale gelmektedir. Bu nedenle, hastada bilinmeyen önemi türevleri (VUS) ve patojenite test etmek için yeni paradigmalar geliştirmek ve uygulamak gereklidir. Bu testler daha sonra zaman ve maliyet-etkin, doğru olmalıdır, ve liman potansiyel klinik programı için bir geçiş katalize.
Fareyi geleneksel insan hastalığı modelleme alanında tercih edilen bir araçtır olsa da, Zebra balığı bir bilimsel ve ekonomik olumlu vekil olarak ortaya çıkmaktadır. Fare aksine, Zebra balığı biyoloji gelişmekte olan patolojilerin gerçek zamanlı görüntüleme sağlar embriyo optik netlik yardımıyla tüm gelişim aşamaları, kolay ve zamanında erişim sağlar. <sup> 1 mutant Zebra balığı hatlarının nispeten yeni nesil fonksiyonel çalışmalarda birçok kişi tarafından kullanılan ek test ve modelleme seçenekleri, sağlamıştır, ancak bu teknoloji (1,38 gözden) sınırlı olmak üzere devam ediyor. Sadece elde etmek zahmetli belirli mutasyonların knock-ins ile genetik mutantlar, aynı zamanda tek bir gen içinde mutasyonlar bir dizi test için orta veya yüksek verimlilik analizi için uygun değildir. Önemlisi testleri tek bir paketi miras modu bilgilendirmek için önemlidir hücresel düzeyde (fonksiyonu vs fonksiyonu kazanç örneğin kaybı), de alel patojenik potansiyeli için sadece bilgi vermek değil, aynı zamanda etki yönünü için olabilir ailelerde, özellikle küçük insan soy ağacı genetik iletim modu hakkında sınırlı bilgi liman. Kullanılabilir fare ve Zebra balığı modellerin kullandığı daha Karşılaştırma için, Tablo 1.
Ayrıca dikkat edinyeniden Zebra balığı model sistem doğasında sınırlamalar vardır. Rağmen D. rerio organ sistemlerinin hızlı bir başlangıç gelişme var, cinsel olgunluğa yaklaşık üç ay gerektirir. Bu nedenle, doğum öncesi ve pediatrik başlangıçlı bozukluklar bu geçici ifade modele en uygun. Büyük bir kimyasal bileşik ekranlar yürütülmesi için idealdir da, genetik mutantların kullanılmasını katkı nonsynonymous türevleri binlerce sistematik olarak test için uygun değildir, ve pediatrik bozukluklarda tespit olmaya devam etmektedir.
Tamamlama testleri korunmuş gelişim süreçleri için gerekli molekülleri için özellikle çok, bu deneysel tractability, homoloji yüksek, insan ve Zebra balığı proteinler arasındaki fonksiyonunun korunması yararlanmak burada açıklanan. Şekil 1 çeşitli alel etkileri için test ve kimlik stratejisi özetliyor. Her iki fonksiyon kaybı (LOF) ve baskın deneyleri yapılabilir. LOF için, deney bir morfolino demonte ile ilgi gen baskılanması ve soruşturma altında klinik fenotip ile ilgili olabilir fenotipleri için Assaying ile başlar. Ya da genellikle bir ya dahil uyararak, bir bağlantı kavşağı üzerinde MO koyarak yapıştırma ile müdahale ederek, bastırma ya da yakın Zebra balığı odağı (tbMO çeviri engelleyici morfolino) ve öteleme başlangıç site MO hedefleyerek çeviri engelleyerek ya elde edilebilir intron veya anormal ekson (; SBMO ekleme engelleme morfolino) atlama.
Daha sonra, orthologous insan transkript milli mRNA tanıtıldı ve fenotip ölçülebilir kurtarma ölçülür. Tahlil kurulduktan sonra, insan mesajında aday Mütasyonların ve WT insan mRNA ile aynı verimle MO-kaynaklı fenotip kurtarmak için kabiliyeti açısından tahlil edilebilir. Tersine, aday için dominant alel, insan mRNA (ancak MO) introduc olduğubaskın bir etkiye sahip testi mutasyonların giriş insan klinik durumda gözlenen benzer fenotipleri neden olacaktır ise WT insan mRNA fena halde, Zebra balığı anatomi ve fizyoloji etkilemez bir beklenti ile ed. Bu deney baskın etkisi fonksiyonunun bir kazanç (GOF) veya WT ve mutant insan mRNA harmanlayarak bir dominant-negatif mekanizma ile oluşup oluşmadığını incelemek için ince taneli daha olabilir; GOF etkinlikler için, WT insan mRNA ek olması bekleniyor alakasız, WT ve mutant mRNA karıştırma dominant-negatif aleller için ise mutant mesaj tarafından uyarılan fenotip şiddetini değiştirmek gerekir. Her durumda, öneririz enjeksiyon tüm kombinasyonları (MO mutant insan mRNA vb morfolino vs WT insan mRNA ile tercihen embriyoların aynı kavrama (bkz. Şekil 1) içinde yapılabilir şöyle yorumlanması olduğunu.:
LOF testleri için:
Baskın testleri için:
Acil durum planı:
Yöntemleri, insan genetik hastalık fenotipi (Tablo 2, Şekil 3), çeşitli ilişkili nonsynonymous değişikliklerin tahlil için geçerli genel bir protokol temsil tanımlanmıştır. Bizim yaklaşımlar hastalık fenotipleri üzerinde varyasyon potansiyel etkisini değerlendirmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ve hastalık mekanizmaları (örneğin Bardet-Biedl Sendromu için dominant negatif mutasyon katkısı, bir öncelikle otozomal resesif 17 gibi) incelemek için. Bugüne kadar, sunulan karar ağacı geliştirilmesi yoluyla, biz 1000 allel bir aşırı, nedensel genetik bozukluklar ile ilişkili 200 gen aşan makul maliyet ve zamanda model var.
Burada ayrıntılı olarak ele değil de, aynı zamanda, bu yöntem bu tür kopya sayısı türevleri (CNV'lerin) yanı sıra ve genetik etkileşimler gibi genetik lezyonun diğer türleri, model için uygun olduğunu göstermiştir. Bu tür olayların analizi kapsamı dışındadırBu yöntem açıklama, onlar temelde klinik olarak-uygun fenotipleri indüksiyon veya alevlenmesi belirlemek için aday genler (birlikte enjekte gen çiftleri dahil) sistematik test aynı ilke güveniyor olsa. Örneğin, 16p11.2 KNV içinde 29 genlerin hangi aydınlatmak için enjekte edildi ve kafa bölümü olan 29 genlerinin her birine karşılık gelen gözlenen bir 660 kb genomik kademeli çakışması olan hastalarda gözlenen mikrosefali, mRNA ile ilgili olabilir, boyutu ölçümleri tek bir transkript, KCTD13 önemli bir katkı ortaya, 2 dpf'e ve 5 dpf'e yapılmıştır. 21. Ayrıca, Bardet-Biedl sendromu ve Hirschsprung hastalığı birlikte görüldüğü hastalarda, genomik lezyonların test genetik etkileşimleri için bu model kullandık. 22 ayrı olarak ve eşzamanlı olarak iki klinik kimliklerin nedensel genlerin MO bastırma karşılaştırılması, biz bei olarak elde edilen fenotip saptayabildilerng sinerjik bir etkileşim yerine sadece ilave şiddetine bağlıdır.
Yüksek hassasiyet (% 98) ve ciliopathies 17 katkıda türevleri için özgünlük (>% 82) kurulmuş olmasına rağmen, henüz bu Zebra balığı modellerde tüm fenotipik okuma için genellenebilir olup olmadığını belirlemek için yeterli veri yok. Bunu yapmak için, allel, çok sayıda, her bir fenotipik kategori içinde test edilmesi gerekir, genetik olarak iyi huylu ya da patojen ya da olması beklenmektedir. Bu klinik ortamda bu tür testlerin uygulanması için özellikle önemli olacaktır, VUSs fonksiyonel yorumlanması neyin tanı ve yanlış pozitif ve yanlış negatif sağlam bir anlayış hekim ve hastalar bu tür sonuçların teslim eşlik edebilir sadece yönetimi bilgilendirebilir. Bununla birlikte, bu yöntemler insan genetik hastalığın manzara daha iyi anlaşılmasını doğru önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Biz bu modellerin sadece bir foun olarak hizmet etmeyeceğini tahminKlinik genetik bilginin daha iyi yorumlanması için adaylığını koyduktan değil, aynı zamanda tedavi edici ekranlar yapmak için yararlı model olarak istihdam edilecek. vivo veriler aynı zamanda PolyPhen 23 gibi kaynaklardan siliko hesaplama tahminleri ile karşılaştırıldığında olabilir, 24 SIFT, SNP ve GO 25, ya da 26 MutPred uyum göstermek için. Tahmini veritabanları SNP & GO ve MutPred önceki bir çalışmada ise, doğrulukları sadece 0.82 ve 0.81 ulaşan, en doğru olarak bulunmuştur unutmayın. 27
Biz çocuk anatomik defektler (Tablo 2, Şekil 3) bir alt kümesi için bu yöntemlerin sağlamlığı ana hatlarıyla olmasına rağmen, bazı fenotipleri bu yöntemler daha az uysal bulunmaktadır. Bazı istisnalar rağmen, bizim protokole uygun olmayan bozuklukların üç ana sınıf vardır. Erişkin başlangıçlı hastalıklar (örneğin, Parkinson hastalığı gibi) embriyonik bir sistemde modeli için bir sorun teşkil etmektedir. Prog Yavaşdışarı yansıması dejeneratif fenotipleri (örneğin frontotemporal demans gibi) bir fenotip üretmek için MO faaliyet yedi dpf'e pencere daha fazla zaman gerektirebilir. Bu RNAi ve siRNA gibi diğer gen demonte teknolojileri müdahale veya gen hedef aşağılamak için kullanılabilir, ancak bu nedenle de süre sınırlayıcı, hiçbiri, özel stabil, toksik olmayan, veya katille 28 gibi uzun ömürlü olduğu gösterilmiştir fenotipleme için. Üçüncü olarak, bu tür memeli akciğer gibi bazı omurgalı yapılar, Zebra balığı embriyo yeterince orthologous yapı yok. Bu alışılmadık ve istenmeyen bir durumdur dikkatli rağmen Ayrıca, WT insan mRNA enjeksiyon bir fenotip yol açar hangi durumlarda incelenmesi için önerilen bir acil durum planı hazırladık.
Bazı hastalık fenotipleri sonra soyutlama ve taşıyıcı annelik daha büyük bir derecesi gerektirebilir. Bu gen fonksiyonu yeterli modeli ve tr arasındaki fenotipik benzerlik zayıflatmak saptığını mümkündürUE fenotip, ya da bu zebrabalıkları fizyolojisi doğal kaynaklı hastalığın etkilerini zorlaştırmaktadır. Bu tür durumlarda, çıkarma öncesinde üretilen fenotip daha diseksiyon göstermektedir. Bu tahlil için sorunlu fenotipleri Zebra balığı embriyolarının model edildiği bazı başarılı örnekler vermiştir. Örneğin, TCF8 mutasyonlar, Fuchs korneal distrofi (FKH) ilişkili bir genin, erken gelişme bu transkript bilinen rolleri göre bir vekil fenotipik olarak okuma Gastrulasyon kusurlar kullanarak geliştirilen protokol kullanılarak tayin edildi. Diğer durumlarda 29 gibi DNAJB6 mutasyonlar neden erişkin başlangıçlı müsküler distrofi gibi, biz insanların yaşam ilk üç ile dört yıl içinde patoloji kayda değer kas yoksun olmasına rağmen 5dpf embriyolarda myofiber fenotipleri oluşturmak başardık. 19
Burada yer alan geçici mutant modelleri ek olarak, diğerleri de avan almışvücut sistemlerinin çeşitli insan hastalığı modellemek için bu geçici sisteminin ge. Bir örnekte, retinitis pigmentoza retinal hücre ölümü ile sonuçlanan bir gen RP2 demonte göre zebrabalıkları modellenmiş ve retina laminasyon azalmıştır. Beş mutant mRNA dördü kurtarmak için başarısız ise, insan yabani tip mRNA kurtarma, retina laminasyon her üç kat geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. 30, insan duyu bozukluğu Bu modeli morfolojik bir fenotip esas olmasına rağmen, aynı zamanda mümkündür Bu akustik irkilme ya da engellenmesi prepulse gibi uyaranlara tahlil yanıt. 47
Son zamanlarda, bir Zebra balığı modeli amiloid öncü proteini ile Alzheimer hastalığı patogenezinde araştırmak için kullanılmıştır. 31 Yazarlar gen demonte insan mRNA ile kurtarıldı olabilir motor nöronların, düşüklüğüne aksonal akıbet neden gösterdi. Fare modelleri ince phenot görüntülemek gibi bu model, özellikle bilgilendirici olduğu kanıtlanmıştırypes (tek demonte) veya doğum sonrası öldürücülüğü (çift demonte). Gelişimi boyunca in vivo değerlendirmek için zebrabalıkları embriyolar yeteneği azaltılmış amiloid öncü proteini, hem de, proteinin düzgün fonksiyon için bir hücre dışı ve hücre içi etki alanı hem de gerektirir şartıyla doğrudan bir kanıt patojenik bir etki ayırt etmek oldu. Diğer önemli modeller içeren ek müsküler distrofi 32, Elmas Blackfan anemi 33, Axenfeld-Reiger sendromu (göz ve kraniofasial geliştirme) 34, inflamatuvar barsak hastalığı 35 (antibakteriyel aktivite), Parkinson hastalığı 36 (nöron ve hareket kaybı) ve nöbet 37 bu (hidrosefali ve hiperaktivite).
Daha yaygın bir insan hastalığı fenotip özetlemek de gösterilmiştir mutant Zebra balığı çizgilerdir. 1,38 gözden, modelleri lösemi, melanom, dilate kardiyomiyopati, Duchenne müsküler distrofi, dahilve diğerleri çok.
The authors have nothing to disclose.
Biz bir Duke Üniversitesi Dekan Yaz Araştırma Bursu (AN), Amerikan Kalp Derneği (AHA) dostluk 11POST7160006 (CG), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Ulusal Göz Enstitüsü (EED), R01HD04260 hibe R01-EY021872 destek kabul Ulusal Çocuk Sağlığı ve Gelişimi Enstitüsü (NK), Diyabet Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü (NK) den R01DK072301 ve R01DK075972, ve Avrupa Birliği (GA no altında AB 7. ÇP tarafından finanse edilen 241.955, proje SYSCILIA,. EED, NK) NK Ayırt Edici Jean ve George W. Brumley profesörüdür.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |