هنا، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتطوير ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وحساسة ومحددة<em> في الجسم الحي</em> المقايسات لتفسير التباين في علم الأمراض البشرية. التلاعب الجيني عابرة عبر Microinjection من WT ومتحولة مرنا الإنسان وmorpholino (MO) أليغنوكليوتيد] العقاقير تسخير معرفة منشأ من البلدان النامية الجنين الزرد لفحص الطفرات المسببة للأمراض بسرعة، وخاصة، ولكن ليس على سبيل الحصر، في سياق اضطرابات النمو البشري.
هنا، فإننا نقدم طرق لتطوير المقايسات للاستعلام تغييرات nonsynonymous يحتمل أن تكون هامة سريريا باستخدام تكامل في الجسم الحي في الزرد. الزرد (دانيو rerio) هي نظام الحيوانية مفيدة بسبب معرفة منشأ بهم التجريبية؛ أجنة شفافة لتمكين عرض السطحية، والخضوع السريع فيفو السابقين التنمية، ويمكن التلاعب بها وراثيا 1 وقد سمحت هذه الجوانب لتحقيق تقدم كبير في تحليل التطور الجنيني،. العمليات الجزيئية، والتخلق الإشارة. أخذت معا، ومزايا هذا النموذج الفقاريات جعل الزرد قابلة للغاية لنمذجة العيوب التنموية في أمراض الأطفال، وفي بعض الحالات، واضطرابات يظهر في مرحلة الكهولة. لأن الجينوم الزرد يتم حفظها للغاية مع أن البشر (~ 70٪ orthologous)، فمن الممكن أن ألخص الحالات المرضية البشرية في الزرد. ويتم إنجاز هذا إما عن طريق الحقن من M الإنسان متحولةالحمض النووي الريبي للحث على زيادة المهيمنة سلبية أو الأليلات وظيفة، أو الاستفادة من morpholino (MO) أليغنوكليوتيد] العقاقير لقمع الجينات لتقليد فقدان المتغيرات وظيفة. من خلال تكامل من الظواهر MO التي يسببها الإنسان مرنا مع المغطاة، نهجنا تمكن تفسير تأثير ضار من الطفرات في تسلسل البروتين البشري يعتمد على قدرة مرنا متحولة لانقاذ قابلة للقياس، النمط الظاهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. النمذجة من الأليلات الأمراض التي تصيب البشر يحدث من خلال Microinjection من الأجنة الزرد مع MO و / أو مرنا البشري في مرحلة الخلية 1-4، وphenotyping تصل إلى سبعة أيام بعد الإخصاب (DPF). ويمكن تمديد هذه الاستراتيجية العامة لمجموعة واسعة من الظواهر المرض، كما هو موضح في بروتوكول التالية. نقدم نماذجنا التي أنشئت لالتخلق إشارات، القحفي، القلب، وسلامة الأوعية الدموية، وظيفة الكلى، والهيكل العظمي الظواهر اضطراب العضلات، فضلا عن غيرهم.
تفسير وظيفي من المعلومات الوراثية والتنازل عن قيمة السريرية التنبؤية إلى التركيب الوراثي يمثل مشكلة كبيرة في مجال علم الوراثة الطبية وأصبحت مؤثرة على نحو متزايد مع الجدوى التقنية والاقتصادية المتسارعة من تسلسل الجينوم واسعة. ولذلك، فمن الضروري لتطوير وتنفيذ نماذج جديدة لاختبار الإمراضية من المتغيرات ذات الأهمية غير معروف (VUS) الكشف في المرضى. يجب أن تكون هذه المقايسات ثم دقيقة، والوقت وفعالة من حيث التكلفة، والميناء القدرة على تحفيز التحول إلى فائدة سريرية.
بينما كان الماوس تقليديا أداة للاختيار في مجال النمذجة الأمراض التي تصيب البشر، الزرد آخذة في الظهور كبديل علميا ومواتية اقتصاديا. على عكس الفأر، الزرد البيولوجيا يتيح الوصول السهل والمناسب لجميع مراحل النمو، وساعد على وضوح بصري من الأجنة التي تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي من الأمراض النامية. <sup> 1 وقدمت جيل حديث نسبيا من خطوط الزرد متحولة إجراء اختبارات إضافية وخيارات النمذجة، والتي تستخدمها العديد من الدراسات في وظيفية، ولكن لا تزال هذه التكنولوجيا لتكون محدودة (تم استعراضها في 1،38). ليس فقط هي المسوخ الجينية مع المغلوب الإضافية من الطفرات محددة شاقة لتحقيق، بل هي أيضا غير قابلة للتحليل متوسطة أو عالية الإنتاجية لاختبار مجموعة من الطفرات في جين واحد. الأهم من ذلك، يمكن للجناح واحد من الاختبارات تقديم معلومات ليس فقط عن القدرة المسببة للأمراض من الأليلات، ولكن أيضا لاتجاه تأثير على المستوى الخلوي (مثل فقدان وظيفة مقابل مكاسب من وظيفة)، وهو أمر حاسم لوضع الميراث إعلام في الأسر، وخصوصا عندما تؤوي الأنساب بشرية صغيرة معلومات محدودة عن طريقة انتقال الوراثية. لمزيد من المقارنة لاستخدامات الماوس المتاحة والنماذج الزرد، انظر الجدول رقم 1.
نلاحظ أيضا أنإعادة قيود متأصلة في النظام النموذجي الزرد. على الرغم من أن د. rerio يكون التطوير الأولي السريع للأجهزة الجسم، النضج الجنسي يتطلب ما يقرب من ثلاثة أشهر. وبسبب هذا، واضطرابات ما قبل الولادة والأطفال الظهور هي الأكثر قابلية لهذا النموذج التعبير عابر. في حين المثالي لإجراء شاشات كبيرة مركب كيميائي، واستخدام المسوخ الجينية ليست مجدية لاختبار منهجي الآلاف من المتغيرات التي تسهم في nonsynonymous، والاستمرار في الكشف عن الاضطرابات في طب الأطفال.
الاختبارات تكامل وصفها هنا الاستفادة من هذا معرفة منشأ التجريبية، ودرجة عالية من التماثل، والحفاظ على وظيفة بين البروتينات البشرية والزرد، بشكل خاص بالنسبة لجزيئات اللازمة لعمليات الحفظ التنموية. الشكل 1 يبين الاختبار وتحديد استراتيجية للآثار أليل مختلف. كلا فقدان وظيفة (LOF) والمقايسات المهيمنة لا يمكن أن يؤديها. لLOF، تبدأ التجربة مع قمع الجينات في المصالح مع ضربة قاضية morpholino، ويعاير لالظواهر التي قد تكون ذات صلة إلى النمط الظاهري السريرية قيد التحقيق. لا يمكن أن يتحقق قمع إما عن طريق منع ترجمة من خلال استهداف MO في أو قرب بدء موقع متعدية من الزرد موضع (ترجمة مانع morpholino؛ tbMO) أو عن طريق التداخل مع الربط عن طريق وضع MO على تقاطع لصق، الأمر الذي أدى عادة إما إدراج إنترون اكسون أو الشاذة تخطي (لصق حجب morpholino؛ sbMO).
وفي وقت لاحق، وقدم مرنا توج من نص الإنسان orthologous ويتم قياس الانقاذ قابلة للقياس الكمي من النمط الظاهري. وبمجرد إنشاء الفحص، ويمكن إدخال طفرات مرشح في رسالة الإنسان ويعاير لقدرتها على إنقاذ النمط الظاهري MO التي يسببها في نفس الكفاءة ومرنا الإنسان WT. وعلى العكس، لمرشح الأليلات السائدة، مرنا الإنسان (ولكن ليس MO) هي introducإد مع توقع بأن مرنا الإنسان WT لن يؤثر بشكل صارخ علم التشريح وعلم وظائف الزرد، في حين مقدمة من الطفرات اختبار أن يكون لها تأثير مهيمن من شأنها أن تحفز الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في حالة اكلينيكية على البشر. هذه التجربة يمكن أن تكون كذلك غرامة الحبيبات لتشريح ما إذا كان الأثر المهيمن يحدث من قبل مكسب من وظيفة (GOF) أو آلية المهيمنة السلبية عن طريق مزج مرنا الإنسان WT ومتحولة؛ للأحداث GOF، إضافة مرنا الإنسان WT ومن المتوقع أن يكون غير ذي صلة، في حين لالأليلات السائدة السلبية، ومزج من مرنا WT ومتحولة وينبغي تغيير شدة النمط الظاهري الناجمة عن رسالة متحولة. في جميع الحالات، ونحن نوصي جميع مجموعات من حقن (MO مع مرنا الإنسان WT مقابل morpholino مع متحولة الإنسان الخ مرنا أن يؤديها، ويفضل في نفس القابض من الأجنة (انظر الشكل 1) التفسير هو على النحو التالي:
لاختبارات LOF:
لاختبارات السائدة:
خطة طوارئ:
الطرق الموضحة هنا تمثل بروتوكول عام ينطبق على فحص التغيرات nonsynonymous يرتبط مع مجموعة متنوعة من الظواهر مرض وراثي الإنسان (الجدول 2، الشكل 3). وقد أثبتت نهجنا مفيدة لتقييم التأثير المحتمل للتغير في الظواهر المرض، والمساعدة في تشريح آليات المرض (مثل مساهمة الطفرات السلبية المهيمنة لمتلازمة بارديه-بيدل، وهو اضطراب وراثي جسمي مقهور في المقام الأول 17). حتى الآن، من خلال وضع شجرة القرارات المقدمة، قمنا غرار بتكلفة معقولة والوقت ما يزيد على 200 الجينات المرتبطة سببيا مع اضطرابات وراثية، إلى وجود فائض من 1،000 الأليلات.
على الرغم من أن لم تناقش بالتفصيل هنا، لقد أظهرنا أيضا أن هذه الأساليب هي المناسبة لنمذجة أنواع أخرى من الآفات الجينية، مثل التنوع في عدد النسخ (التنوعات في عدد النسخ)، وكذلك والوراثية التفاعلات. التحليلات لمثل هذه الأحداث هي خارجة عن نطاقوصف الطريقة الحالية، على الرغم من أنها تعتمد بشكل أساسي على نفس مبدأ الاختبار المنهجي للجينات مرشحة (بما في ذلك زوج من الجينات في وقت واحد حقن) لتحديد الاستقراء أو تفاقم الظواهر مناسبة سريريا. على سبيل المثال، لتوضيح أي من الجينات 29 في 16p11.2 CNV قد تكون ذات صلة إلى صغر الرأس الملحوظة لوحظ في المرضى الذين يعانون من الازدواجية من 660 قطعة الجيني كيلوبايت، mRNAs والمقابلة لكل من الجينات 29 ضمن القطعة تم حقن ورئيس أجريت قياسات حجم في 2 و 5 DPF DPF، وكشف عن مساهمة كبيرة من نسخة واحدة، KCTD13 21 بالإضافة إلى ذلك، وقد استخدمنا هذا النموذج للتفاعلات وراثية فحص الآفات الجيني في المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه على حد سواء-بيدل والمرض هيرشسبرونغ 22 من خلال المقارنة بين MO قمع الجينات المسببة للاثنين هويات السريرية بشكل منفصل في وقت واحد، وكنا قادرين على تحديد النمط الظاهري الناتج كما باينانوغرام تفاعل التآزر بدلا من مجرد شدة المضافة.
على الرغم من قيامه بإنشاء حساسية عالية (98٪) والنوعية (> 82٪) عن المتغيرات التي تسهم في ciliopathies 17، ليس لدينا حتى الآن بيانات كافية لتحديد ما إذا كانت هذه قابلة للتعميم لجميع قراءات المظهري في نماذج الزرد. وتوقع عدد كبير من الأليلات، أن تفعل ذلك وراثيا لتكون إما حميدة أو المسببة للأمراض، يجب أن يتم اختبار داخل كل فئة المظهري. وسوف يكون هذا أهمية خاصة لتنفيذ مثل هذه المقايسات في إعداد سريرية، حيث تفسير وظيفي من VUSs يمكن إبلاغ التشخيص والتدبير العلاجي فقط إذا فهم قوية من ايجابيات كاذبة والسلبيات كاذبة يمكن أن تصاحب تقديم هذه النتائج إلى الأطباء والمرضى. ومع ذلك، يمكن لهذه الأساليب تسهم إسهاما كبيرا نحو فهم أفضل لطبيعة المرض الوراثية البشرية. ونحن نتوقع أن هذه النماذج لا إلا أن تكون بمثابة founكما سيتم توظيف dation لتحسين تفسير المعلومات الجينية السريرية، ولكن كنماذج المفيد إجراء شاشات العلاجية. في البيانات الجسم الحي كما يمكن مقارنة في سيليكون والتوقعات الحسابية من مصادر مثل PolyPhen 23، فرزت 24، تعدد الأشكال وGO 25، أو MutPred 26 لإظهار التوافق. لاحظ أنه تم العثور عليها في دراسة سابقة للتنبؤ قواعد البيانات النيوكلوتايد & GO وMutPred ليكون أكثر دقة، مع دقة تصل إلى 0.82 و 0.81 فقط، على التوالي. 27
على الرغم من أننا قد أوجز متانة هذه الأساليب لمجموعة فرعية من العيوب التشريحية للأطفال (الجدول 2، الشكل 3)، وبعض الظواهر هي أقل لين العريكة بواسطة هذه الأساليب. على الرغم من وجود بعض الاستثناءات، وهناك ثلاث فئات رئيسية من اضطرابات غير قابلة للبروتوكول لدينا. اضطرابات يظهر في مرحلة الكهولة (مثل مرض باركنسون) تمثل تحديا لنموذج في نظام الجنينية. بطء بروغression الظواهر التنكسية (مثل الخرف الجبهي) قد تتطلب وقتا أكثر مما النافذة DPF سبعة من النشاط MO لإنتاج النمط الظاهري. تكنولوجيات ضربة قاضية الجينات الأخرى مثل رني وسيرنا متاحة لتتداخل مع أو تحط من الجين المستهدف، ولكن ثبت أن لا شيء غير محددة ومستقرة، وغير سامة، أو طويلة الأمد كما المنظمات الأعضاء 28، مما يحد أيضا الإطار الزمني لphenotyping. ثالثا، بعض الهياكل الفقارية، مثل الرئة الثدييات، لا يكون لها هيكل orthologous بما فيه الكفاية في الجنين الزرد. قدمنا أيضا خطة طوارئ اقترح للتحقيق في تلك الحالات التي WT حقن مرنا الإنسان يؤدي إلى النمط الظاهري، على الرغم من أننا نحذر هذه حالة غير عادية وغير مرغوب فيه.
قد بعض الظواهر المرض ثم تتطلب درجة أكبر من التجريد وتأجير الأرحام. فمن الممكن أن وظيفة الجين قد تباعدت بما فيه الكفاية لإضعاف التشابه المظهري بين نموذج و TRUE النمط الظاهري، أو أن الزرد علم وظائف الأعضاء يعقد بطبيعتها آثار المرض التي يسببها. في مثل هذه الحالات، فإننا نقترح مزيد من تشريح النمط الظاهري أنتجت قبل الفصل. لقد أنتجنا بعض الأمثلة الناجحة التي تم غرار الظواهر الإشكالية لهذا الاختبار في الأجنة الزرد. على سبيل المثال، والطفرات في TCF8، ويعاير الجين المرتبط فوكس ضمور القرنية (FCD)، وذلك باستخدام بروتوكول لدينا باستخدام العيوب تكون المعيدة باعتبارها قراءات المظهري بديلة استنادا إلى الأدوار المعروفة لهذا النص في التنمية في وقت مبكر. 29 وفي حالات أخرى، مثل كما الحثل العضلي الذي يصيب البالغين التي تسببها طفرات في DNAJB6، كنا قادرين على توليد الظواهر ليف عضلي في الأجنة 5dpf على الرغم من حقيقة أن البشر هم مجردة من العضلات ملموس في علم الأمراض من العقود الثلاثة أو الأربعة الأولى من الحياة. 19
بالإضافة إلى نماذج متحولة عابر المعروضة هنا، اتخذت الآخرين أيضا ADVANTAجنرال الكتريك لهذا النظام عابرة إلى نموذج المرض الإنسان في مجموعة متنوعة من أجهزة الجسم. في مثال واحد، كان على غرار التهاب الشبكية الصباغي في الزرد من قبل ضربة قاضية للRP2 الجينات، مما يؤدي إلى موت الخلايا في شبكية العين وانخفاض التصفيح الشبكية. أدى الانقاذ مع الإنسان مرنا من النوع البري في التنمية من جميع الطبقات الثلاث من التصفيح في شبكية العين، في حين أن أربعة من أصل خمسة mRNAs ومتحولة فشلت في إنقاذ 30 على الرغم من أن هذا النموذج من اضطراب الحواس البشرية يستند إلى النمط الظاهري المورفولوجية، فمن الممكن أيضا أن استجابة مقايسة للمؤثرات مثل جفل الصوتية أو prepulse تثبيط 47
مؤخرا، تم استخدام نموذج الزرد للتحقيق الزهايمر المرضية المرض من خلال بروتين اميلويد السلائف. أظهرت 31 المؤلفان أن تسبب ضربة قاضية الجينات ضعاف ثمرة محواري الخلايا العصبية الحركية، والتي يمكن انقاذ مع مرنا الإنسان. وقد أثبت هذا النموذج لتكون خاصة بالمعلومات، كما عرض نماذج الماوس فقط phenot خفيةypes (ضربة قاضية واحدة) أو الفتك بعد الولادة (ضربة قاضية مزدوجة). ساعدت القدرة على تقييم الأجنة الزرد في الجسم الحي خلال مراحل تطوره لتبين تأثير المسببة للأمراض انخفاض بروتين اميلويد السلائف، وكذلك أدلة مباشرة على أن يكون البروتين يتطلب مجال خارج الخلية وبين الخلايا من أجل وظيفة مناسبة. وتشمل نماذج بارزة أخرى من ضمور العضلات إضافية 32، الماس Blackfan فقر الدم 33، آكسينفيلد-Reiger متلازمة (تطوير العين والجمجمة) 34، مرض التهاب الأمعاء 35 (نشاط مضاد للجراثيم)، مرض باركنسون 36 (الخلايا العصبية وفقدان تحرك)، ومصادرة 37 (استسقاء الرأس وفرط النشاط).
أكثر شيوعا هي خطوط الزرد متحولة التي ثبت أيضا أن ألخص النمط الظاهري الأمراض التي تصيب البشر. استعرضت في 1،38، وتشمل نماذج سرطان الدم، سرطان الجلد، بعضلة القلب المتوسعة، ضمور العضلات دوشين،وغيرها الكثير.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نعترف الدعم من الصيف بحوث زمالة جامعة ديوك العميد (AN)، جمعية القلب الأمريكية (AHA) زمالة 11POST7160006 (CG)، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منح R01-EY021872 من المعهد الوطني للعيون (EED)، R01HD04260 من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية (NK)، R01DK072301 وR01DK075972 من المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي واضطرابات في الكلى (NK)، والاتحاد الأوروبي (بتمويل من الاتحاد الأوروبي ال 7 FP تحت GA NR 241955، مشروع SYSCILIA؛. EED، NK) NK هو جان الكرام وجورج BRUMLEY أستاذ.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |