Здесь мы представляем систематический подход к разработке соответствующих физиологически, чувствительность и специфичность<em> В естественных условиях</em> Анализов для интерпретации изменения в патологии человека. Переходные генетической манипуляции с помощью микроинъекции дикого типа и мутантного человеческого мРНК и морфолино (MO) антисмысловые олигонуклеотиды использовать трактабильность развивающегося эмбриона данио быстрого анализа патогенных мутаций, особенно, но не исключительно, в контексте человеческого развития расстройств.
Здесь приведены методы для развития анализов для запроса потенциально клинически значимых изменений несинонимичных использованием в естественных условиях дополнения в данио рерио. Данио рерио (Danio рерио) являются полезной системы животных в связи с их экспериментальными уступчивость; эмбрионы являются прозрачными для легкого включить осмотр, подвергаются быстрому развитию естественных бывшие, и может быть генетически модифицированных 1 Эти аспекты позволили значительные успехи в анализе эмбриогенеза. молекулярные процессы и морфогенетические сигнализации. Взятые вместе, преимущества этой модели позвоночных сделать данио наиболее подходящей основы для моделирования дефектов развития у детей заболеваний, а в некоторых случаях, во взрослом возрасте нарушений. Поскольку генома данио высоко консервативен с у человека (~ 70% ортологи), можно резюмировать человека болезненных состояний данио рерио. Это достигается либо за счет введения мутантного человеческого мРНК чтобы вызвать доминантных негативных или усиления функции аллелей, или использование морфолино (MO) антисмысловые олигонуклеотиды, чтобы подавить гены, чтобы имитировать потерю функции вариантах. Через комплементации MO-индуцированной фенотипов с крышками мРНК человеческого, наш подход позволяет интерпретации вредного влияния мутаций на последовательность человеческого белка основано на способности мутантных мРНК, чтобы спасти измеримыми, физиологически значимых фенотип. Моделирование человеческого аллелей болезни происходит через микроинъекции эмбрионы рыбок данио с Мо и / или мРНК человека на 1-4 клеточной стадии, а фенотипирование до семи дней после оплодотворения (DPF). Эта общая стратегия может быть распространен на широкий круг заболеваний фенотипы, как показано в следующей методике. Мы представляем наши модели созданы для морфогенетических сигнализации, черепно-лицевые, сердечные, сосудистые целостности, функции почек, скелетных мышц фенотипа расстройства, а также другие.
Функциональная интерпретация генетической информации и присвоение интеллектуального клинического значения генотипа представляет основную проблему в медицинской генетике и становится все более острой с ускоряющим технической и экономической целесообразности генома секвенирования. Таким образом, необходимо разработать и осуществить новые парадигмы для проверки патогенности варианты неизвестного значения (VUS) обнаружены у пациентов. Эти анализы должны затем быть точным, времени и экономически эффективной, и гавань потенциал, чтобы стимулировать переход к клинической полезности.
В то время как мыши традиционно инструментом выбора в области моделирования человеческих заболеваний, данио становятся научно и экономически благоприятных суррогат. В отличие от мыши, данио биологии позволяет легко и своевременный доступ к всех стадиях развития, опираясь на оптическую прозрачность эмбрионов которая позволяет в режиме реального времени изображения развивающихся патологий. <sup> 1 Относительно последнего поколения мутантные линии данио предоставил дополнительное тестирование и моделирование вариантов, используется многими в функциональных исследований, но эта технология продолжает быть ограничен (см. обзор в 1,38). Мало того, что генетические мутанты с стук модули специфических мутаций трудоемкий достичь, они также не поддаются средней или высокой пропускной способности анализа для тестирования целого ряда мутаций в одном гене. Важно отметить, что один набор тестов можно получить информацию не только для потенциальных патогенных аллелей, но и для направления эффект на клеточном уровне (например, потерей функции по сравнению с усилением функции), который является критическим для информирования способ наследования в семьях, особенно когда маленькие человеческие родословные питать ограниченную информацию о режиме генетической передачи. Для дальнейшего сравнения использования доступны мышей и рыбок данио модели, см. таблицу 1.
Отметим также, чтоRe присущи ограничения на данио модели системы. Хотя D. рерио имеют быстрое начальное развитие органов и систем, половой зрелости требуется приблизительно три месяца. Из-за этого, пренатальной и педиатрического начала расстройства являются наиболее поддаются этого переходного модель выражения. Хотя идеально подходит для проведения больших экранах химическое соединение, использование генетических мутантов не представляется возможным для систематического тестирования тысяч несинонимичных варианты, которые способствуют, и продолжают быть обнаружены в педиатрической расстройств.
Дополнения испытания, описанные здесь, воспользоваться этой экспериментальной уступчивость, высокой степенью гомологии, и поддержания функции между человеком и рыбок данио белков, в частности, так и для молекул, необходимых для консервативных процессов развития. Рисунке 1 представлены тестирования и стратегии идентификации для различных эффектов аллеля. Оба потери функции (LOF) и доминирующей анализы могут быть выполнены. Для LOF, эксперимент начинается с подавления гена с морфолино нокдаун, и анализа на фенотипы, которые могут иметь отношение к клиническим фенотипом под следствием. Подавление может быть достигнута либо путем блокирования перевод от ориентации MO на или вблизи поступательного сайт начала данио локус (перевод блокатор морфолино; ТБМО), либо путем вмешательства сплайсинга, поместив MO на сплайсинга, обычно вызывая либо включением интронов или аберрантными пропуска экзонов (Слить блокирование морфолиногруппы; SBMO).
Впоследствии, капо мРНК из ортологичных человека транскрипт введен и количественно спасательных фенотипа измеряется. После анализа установлено, кандидат мутации в человеческом сообщение может быть введен и анализировали на их способность спасти MO-индуцированной фенотип при той же эффективности, как WT человеческой мРНК. Наоборот, для кандидата доминантные аллели, человеческая мРНК (но не МО) при введенииЭд с ожиданием, что WT мРНК человеческого не будет грубо влиять данио анатомии и физиологии, в то время как введение теста мутаций, которые имеют доминирующее влияние будет вызывать фенотипа аналогичные тем, которые наблюдались в человеческом клинического состояния. Этот эксперимент может быть мелкозернистой дальнейшего препарировать ли доминирующий эффект происходит за счет усиления функции (ГОФ) или доминантно-негативный механизм путем смешивания WT и мутантных мРНК человеческого, ибо события ГОФ, добавление WT мРНК человеческого как ожидается, будет значения, в то время как для доминантно-негативный аллелей, смешивание дикого типа и мутантных мРНК должны изменять тяжести фенотипа индуцированного мутанта сообщение. Во всех случаях, мы рекомендуем, что все комбинации инъекций (MO с WT против мРНК человеческого морфолиногруппу с мутантным человека и т.д. мРНК быть выполнены, предпочтительно в пределах одного сцепления эмбрионов (см. Рисунок 1) интерпретация состоит в следующем.:
Для LOF тесты:
Для доминирующего тесты:
Резервный план:
Методы, описанные здесь, представляют собой общий протокол применимо к анализом несинонимичных изменения, связанные с разнообразием человеческих генетических заболеваний фенотипов (таблица 2, рисунок 3). Наши подходы доказали свою полезность для оценки потенциального воздействия на изменение фенотипа заболевания, а также помочь рассекают механизмов заболевания (например, вклад доминантной негативной мутации Барде-Бидля, в первую очередь аутосомно-рецессивные расстройства 17). На сегодняшний день через развитие представлено дерево принятия решений, мы смоделировали по разумной цене и времени, превышающего 200 генов причинно связаны с генетических нарушений, к избытку 1000 аллелей.
Хотя подробно не рассматриваются здесь, мы также показали, что эти методы являются подходящими для моделирования других типов генетических повреждений, таких как варианты количества копий (ВКК), а также и генетических взаимодействий. Анализ таких событий выходит за рамкинастоящем описании метода, хотя они принципиально полагаться на том же принципе систематического тестирования генов-кандидатов (включая пар генов вводят одновременно), чтобы определить индукции или обострения клинически соответствующие фенотипы. Например, чтобы выяснить, какие из 29 генов в 16p11.2 CNV могут иметь отношение к наблюдаемому Микроцефалия наблюдается у пациентов с дублированием 660 кб геномных сегментов, мРНК, соответствующей каждому из 29 генов в сегменте вводили и головы Размер измерения проводились при 2 и 5 DPF DPF, показывая крупным вкладом одной стенограммы, KCTD13. 21 Кроме того, мы использовали эту модель для анализа генетических взаимодействий геномных повреждений у пациентов как Барде-Бидля синдрома и болезни Гиршпрунга. +22 Путем сравнения MO подавление причинных генов из двух клинических тождества по отдельности и одновременно, мы смогли определить полученную фенотип как Beiнг синергическое взаимодействие, а не просто добавка тяжести.
Несмотря установив высокую чувствительность (98%) и специфичность (> 82%) для варианта способствующих цилиопатий 17, мы еще не имеют достаточных данных, чтобы определить, если они распространены на всех фенотипических показания у рыбок данио моделей. Для этого, большое количество аллелей, предсказанный генетически быть доброкачественными или патогенным, должны быть проверены в пределах каждого фенотипического категории. Это будет особенно важно для реализации таких анализов в клинических условиях, где функциональная интерпретация ВУСС можете сообщить диагностики и лечения только при наличии здоровой понимание ложных срабатываний и ложных негативов могут сопровождать поставку таких результатов для врачей и пациентов. Тем не менее, эти методы могут внести существенный вклад в сторону лучшего понимания ландшафта человеческих генетических заболеваний. Мы ожидаем, что эти модели будут не только служить осноdation для улучшения интерпретации клинических генетической информации, но также могут быть использованы в качестве полезных моделей проводить терапевтический экранов. В естественных данные также могут быть по сравнению с в кремнии вычислительные прогнозы из таких источников, как PolyPhen 23, плотные 24, ОНП-GO 25 или MutPred 26 показать согласования. Обратите внимание, что в предыдущем исследовании прогнозирования баз данных ОНП & GO и MutPred были признаны наиболее точными, с точностью составив лишь 0,82 и 0,81, соответственно. 27
Хотя мы наметили надежность этих методов для подмножества педиатрической анатомические дефекты (табл. 2, рис 3), некоторые фенотипы менее послушными с помощью этих методов. Некоторые исключения несмотря на это, существует три основных класса расстройства не поддаются нашему протоколу. Взрослом возрасте расстройств (таких как болезнь Паркинсона) представляют собой вызов модель в эмбриональных системы. Медленно прогression дегенеративных фенотипов (например, лобно-височная деменция), может потребоваться больше времени, чем семь окно денье активности MO производить фенотип. Другой ген нокдаун технологий, таких как RNAi и миРНК можно препятствовать или ухудшить гена-мишени, но было показано, что ни один из них, как конкретные, стабильные, нетоксичные, или длительным как МО 28, что также ограничивает срок для фенотипа. В-третьих, некоторые позвоночных структур, таких как млекопитающие легкие, не имеют достаточно ортологи структуры в данио эмбриона. Мы также предоставили предложил план действий в чрезвычайных для расследования этих дел, в которых человеку WT инъекции мРНК приводит к фенотипу, хотя мы предупреждаем, это необычная и нежелательные ситуации.
Некоторые фенотипа заболевания может затем требуют большей степенью абстракции и суррогатного материнства. Вполне возможно, что функции гена приводит к отклонению достаточно, чтобы ослабить фенотипического сходства между моделью и трие фенотип, или что данио физиологии сути усложняет эффектов индуцированного заболевания. В таких случаях мы предлагаем дальнейшее вскрытие производится фенотипа до увольнения. Мы подготовили несколько успешных примеров, в которых проблематично фенотипа для этого анализа были смоделированы у эмбрионов данио рерио. Например, мутации в TCF8, ген, связанный с Fuchs дистрофии роговицы (ГТД), анализировали с помощью нашего протокола с помощью гаструляции дефектов в качестве суррогатного фенотипических считывания на основе известной роли этого транскрипта в раннем развитии. 29 В других случаях такие как во взрослом возрасте мышечная дистрофия вызывается мутациями в DNAJB6, мы были способны генерировать мышечное волокно фенотипа в 5dpf эмбрионов, несмотря на то, что люди лишены заметных мышц патологии в первые три-четыре десятилетия жизни. 19
В дополнение к переходным мутант модели, представленные здесь, другие также принимают выгодноеGE этого переходного система для моделирования болезней человека в различных системах организма. В одном примере, пигментный ретинит был смоделирован в данио по нокдаун гена RP2, что приводит к гибели клеток сетчатки и снижение сетчатки ламинирования. Спасательные с человека дикого типа мРНК привело к развитию всех трех слоев сетчатки ламинирование, в то время как четыре из пяти мутант мРНК не удалось спасти. 30 Хотя эта модель человеческого сенсорных расстройств основан на морфологические фенотип, это также можно Анализ ответ на стимулы, такие как акустические испуга или предымпульсе торможения. 47
Недавно модель данио был использован для исследования болезни Альцгеймера патогенез через белка-предшественника амилоида. 31 Авторы показали, что ген нокдаун вызванных нарушением аксонный отросток двигательных нейронов, которые могут быть спасены с человеческой мРНК. Эта модель оказалась особенно информативны, как мышь модели отображают только тонкие phenotYpes (одного нокдауна) или послеродового летальности (двойной нокдаун). Способность оценить эмбрионов данио рерио в естественных условиях на протяжении развития помогли различить патогенный эффект уменьшения амилоидного белка-предшественника, а также при условии прямой доказательства того, что белок требует как внеклеточный и внутриклеточный домен для нормальной работы. Другие известные модели включают в себя, что дополнительные мышечные дистрофии 32, Diamond Blackfan анемии 33, Axenfeld Reiger-синдром (глаз и черепно-лицевого развития) 34, воспалительные заболевания кишечника 35 (антибактериальной активностью), болезнь Паркинсона 36 (нейрона и передвижения убыток) и захват 37 (гидроцефалия и гиперактивности).
Более распространенными являются мутантные линии данио, которые были показаны также перепросматривать фенотипа человека болезни. Отзыв в 1,38, модели включают лейкоз, меланома, дилатационная кардиомиопатия, мышечная дистрофия Дюшенна,и многие другие.
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем поддержку летних исследований Университета Дьюка Дина стипендия (), Американской ассоциации сердца (AHA) общение 11POST7160006 (CG), Национального института здоровья (NIH) гранты R01-EY021872 от глаз Национального института (EED), R01HD04260 от Национальный институт здоровья ребенка и развития (NK), R01DK072301 и R01DK075972 из Национального института диабета и пищеварительной почек (NK) и Европейского Союза (финансируется ЕС 7-й FP под GA Тел 241955, SYSCILIA проекта;. ЭЭИ, NK) NK является почетным Джин и Джордж Брамли профессор.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |