Aqui, apresentamos uma abordagem sistemática para o desenvolvimento fisiologicamente relevante, sensível e específico<em> In vivo</em> Ensaios para interpretar variações na patologia humana. Manipulação genética transitória via microinjeção de WT e mutantes mRNA humano e morfolino (MO) oligonucleotídeos antisense aproveitar a rastreabilidade do desenvolvimento de embriões do peixe-zebra para rapidamente mutações ensaio patogênicos, especialmente, mas não exclusivamente, no contexto dos transtornos do desenvolvimento humano.
Aqui, apresentamos métodos para o desenvolvimento de ensaios para consultar alterações nonsynonymous potencialmente clinicamente significativas usando em complementação vivo no peixe-zebra. Peixe-zebra (Danio rerio) é um sistema de animais útil devido à sua docilidade experimental; embriões são transparentes para permitir a visualização fácil, submetidos a um desenvolvimento rápido ex vivo, e pode ser manipulado geneticamente um Estes aspectos têm permitido avanços significativos na análise da embriogênese. processos moleculares e morfogenética de sinalização. Tomadas em conjunto, as vantagens desse modelo de vertebrados fazer zebrafish altamente receptivo para modelar os defeitos de desenvolvimento de doença pediátrica e, em alguns casos, distúrbios na idade adulta. Porque o genoma do peixe-zebra é altamente conservada com a dos seres humanos (~ 70% ortólogos), é possível para recapitular estados de doença humana em peixes-zebra. Isto é conseguido através da injecção da m humana mutanteRNA para induzir ganho dominante negativa ou de alelos de função, ou utilização de morfolino (MO), os oligonucleótidos anti-sentido para suprimir genes para imitar a perda de função de variantes. Através de complementação do fenótipo MO induzidas com ARNm humano tampado, a nossa abordagem permite a interpretação do efeito deletério de mutações em sequência da proteína humana, com base na capacidade de ARNm mutante para resgatar um mensurável, fenótipo fisiologicamente relevante. Modelando dos alelos humanos da doença ocorre através de microinjecção de embriões de peixes-zebra com MO e / ou ARNm humano no estádio de célula de 1-4, e fenotipagem até sete dias após a fertilização (dpf). Esta estratégia geral pode ser alargada a uma vasta gama de condições clínicas, como demonstrado no seguinte protocolo. Apresentamos nossos modelos estabelecidos para morfogenética de sinalização, integridade craniofacial, cardíaco, vascular, função renal, e esqueléticos fenótipos desordem muscular, bem como outros.
A interpretação funcional da informação genética e atribuição do valor clínico preditivo de um genótipo representa um grande problema em genética médica e está se tornando cada vez mais pungente com a aceleração de viabilidade técnica e econômica do seqüenciamento do genoma. Por conseguinte, é necessário desenvolver e implementar novos paradigmas para testar a patogenicidade das variantes de significado desconhecido (USV) detectados em pacientes. Estes ensaios devem, então, ser exato, tempo e custo-eficiente, e do porto o potencial para catalisar uma transição para a utilidade clínica.
Enquanto o rato tem sido tradicionalmente a ferramenta de escolha no campo da modelagem de doenças humanas, zebrafish estão emergindo como um substituto científica e economicamente favorável. Ao contrário do rato, peixe-zebra biologia permite o acesso fácil e oportuno para todas as fases de desenvolvimento, auxiliados por claridade óptica dos embriões, que permite imagens em tempo real de desenvolvimento de patologias. <sup> 1 A relativamente recente geração de linhas de peixe-zebra mutante tem proporcionado testes adicionais e opções de modelagem, utilizada por muitos em estudos funcionais, mas esta tecnologia continua a ser limitado (revisado em 1,38). Não são apenas os mutantes genéticos com knock-ins de mutações específicas laboriosas para atingir, não são também acessíveis à análise de médio ou elevado rendimento para o ensaio de uma série de mutações num único gene. Importante, um único conjunto de testes pode proporcionar informação não só para o potencial patogénico de alelos, mas também para a direcção do efeito a nível celular (por exemplo, perda da função versus ganho de função), o qual é crítico para o modo de hereditariedade informando nas famílias, especialmente quando pequenos pedigrees humanos abrigam poucas informações sobre o modo de transmissão genética. Para posterior comparação dos usos do rato disponíveis e modelos de peixe-zebra, ver Tabela 1.
Observamos também que ore são limitações inerentes ao sistema modelo zebrafish. Embora D. rerio tem rápido desenvolvimento inicial de sistemas de órgãos, a maturidade sexual requer aproximadamente três meses. Devido a isso, distúrbios pré-natal e pediátrica de início são as mais susceptíveis a este modelo de expressão transitória. Enquanto ideal para a realização de telas de compostos grandes químicos, a utilização de mutantes genéticos não é viável para o teste sistemático de milhares de variantes nonsynonymous que contribuem para, e continuam a ser detectado em doenças pediátricas.
Os testes de complementação descrita aqui tirar proveito desta tratabilidade experimental, elevado grau de homologia, e preservação da função entre as proteínas humanas e peixe-zebra, em particular, para as moléculas necessárias para os processos de desenvolvimento conservadas. Figura 1 descreve a estratégia de identificação e testes para vários efeitos de alelos. A perda de função (LOF) e ensaios dominantes pode ser realizada. Para LOF, a experiência se inicia com a supressão do gene de interesse com um knockdown morfolino, e ensaiando para fenótipos que possam ser relevantes para o fenótipo clínico sob investigação. A supressão pode ser alcançada quer por bloqueio tradução visando um MO no ou perto do local de iniciação da tradução do locus de peixe-zebra (tradução bloqueador morfolino; tbMO), ou por interferência com splicing colocando um MO sobre uma junção de união, tipicamente induzindo ou inclusão de um intron ou exon aberrante pular (emenda bloqueio morpholino; SBMO).
Subsequentemente, o ARNm transcrito a partir do tampado ortólogo humano é introduzido e salvamento quantificável do fenótipo é medido. Uma vez que o ensaio é estabelecida, as mutações candidatas na mensagem humano pode ser introduzido e ensaiadas quanto à sua capacidade para resgatar o fenótipo MO induzida na mesma eficiência que WT ARNm humano. Por outro lado, para o candidato alelos dominantes, mRNA humano (mas não MO) é introduçãoed, com a expectativa de que o ARNm humano WT não irá afectar grandemente a anatomia e fisiologia do peixe-zebra, ao passo que a introdução de mutações de ensaio que tenham um efeito dominante vai induzir fenótipos análogos aos observados no estado clínico em humanos. Esta experiência pode ser refinado para dissecar ainda mais se o efeito dominante ocorre por um ganho de função (GOF), ou um mecanismo negativo dominante misturando WT e mutantes ARNm humano; para eventos GOF, a adição de ARNm humano WT deve ser irrelevante, ao passo que para os alelos dominantes-negativos, misturando de ARNm WT e mutantes devem alterar a gravidade do fenótipo induzido pela mensagem mutante. Em todos os casos, recomendamos que todas as combinações de injeções (MO com WT mRNA humano vs morpholino com mutante mRNA humano etc ser realizada, de preferência dentro da mesma ninhada de embriões (ver Figura 1) A interpretação é a seguinte.:
Para os testes de LOF:
Para os testes dominantes:
Plano de contingência:
Os métodos aqui descritos representam um protocolo geral aplicável para o ensaio de mudanças nonsynonymous associados com uma variedade de fenótipos de doenças genéticas humanas (Tabela 2, Figura 3). Nossas abordagens provaram ser úteis para avaliar o potencial impacto da variação fenótipos da doença, e para ajudar a dissecar mecanismos da doença (como a contribuição de mutações dominantes negativas para a Síndrome de Bardet-Biedl, uma doença autossômica recessiva, principalmente 17). Até à data, por meio do desenvolvimento da árvore de decisão apresentado, foram modelados a um custo razoável e tempo em excesso de 200 genes causalmente associada com desordens genéticas, a um excesso de 1000 alelos.
Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, também têm demonstrado que estes métodos são apropriados para modelar outros tipos de lesões genéticas, como variantes do número de cópia (CNVs), assim como genética e interações. As análises de tais eventos são além do escopoDescrição da presente método, embora eles dependem fundamentalmente o mesmo princípio do teste sistemático de genes candidatos (incluindo os pares de genes injectados simultaneamente) para determinar a indução ou a exacerbação dos fenótipos clinicamente apropriados. Por exemplo, para elucidar quais dos 29 genes na 16p11.2 CNV pode ser relevante para o microcefalia observada observada nos pacientes com a duplicação de um segmento do genoma de 660 kb, mRNAs correspondentes a cada um dos 29 genes dentro do segmento da cabeça e foram injectados medidas de tamanho foram realizadas em dois dpf e 5 dpf, revelando uma grande contribuição de um único transcrito, KCTD13. 21 Além disso, temos usado este modelo para interações genéticas ensaio de lesões genômicas em pacientes com ambos síndrome de Bardet-Biedl e doença de Hirschsprung. 22 Por comparação de MO supressão dos genes causadores de duas identidades clínicos separadamente e simultaneamente, fomos capazes de identificar o fenótipo resultante como being de uma interacção sinérgica e não meramente aditivo gravidade.
Apesar de ter estabelecido alta sensibilidade (98%) e especificidade (> 82%) para as variantes que contribuem para ciliopathies 17, nós ainda não temos dados suficientes para determinar se estes são generalizáveis a todas as leituras fenotípicos em modelos de zebrafish. Para fazer isso, um grande número de alelos, previu geneticamente para ser benignos ou patogénicos, deve ser ensaiado, dentro de cada categoria fenotípica. Isto será particularmente importante para a implementação de tais ensaios em ambiente clínico, onde a interpretação funcional de VUSs pode informar o diagnóstico e tratamento somente se um entendimento robusto de falsos positivos e falsos negativos pode acompanhar a entrega de tais resultados aos médicos e pacientes. No entanto, estes métodos podem contribuir significativamente para uma melhor compreensão da paisagem de doença genética humana. Prevemos que esses modelos não só servir como uma fundadação para melhorar a interpretação da informação genética clínica, mas irá também ser empregues como modelos úteis para realizar telas terapêuticos. Os dados in vivo também pode ser comparado com in silico previsões computacionais a partir de fontes tais como PolyPhen 23, peneire 24, os SNPs & GO 25, ou MutPred 26 para mostrar concordância. Note-se que em um estudo anterior de previsão bancos de dados SNPs & GO e MutPred foram encontrados para ser mais preciso, com precisões atingindo apenas 0,82 e 0,81, respectivamente 27.
Embora tenhamos descrito a robustez destes métodos para um subconjunto de defeitos anatómicos pediátricos (Tabela 2, Figura 3), certos fenótipos são menos tratável por estes métodos. Algumas exceções, não obstante, existem três classes principais de distúrbios não passíveis de nosso protocolo. Desordens de início adulto (tais como a doença de Parkinson), representam um desafio para modelo num sistema embrionário. Lento progression fenótipos degenerativas (tais como demência fronto-temporal) pode necessitar de mais tempo do que a janela dpf sete da actividade MO para produzir um fenótipo. Outras tecnologias de genes tais como o knockdown de RNAi e siRNA estão disponíveis para interferir com ou degradam o gene alvo, mas foi mostrado que nenhum é tão específica, estável, não-tóxico, ou de longa duração como OMs 28, contribuindo assim para limitar o horizonte temporal para fenotipagem. Em terceiro lugar, algumas estruturas de vertebrados, tais como o pulmão de mamífero, não têm uma estrutura suficientemente ortólogos no embrião do peixe-zebra. Temos também um plano de contingência sugerido para investigação de casos em que WT injeção de mRNA humano leva a um fenótipo, embora nós advertimos esta é uma situação incomum e indesejável.
Alguns fenótipos da doença pode então exigir um maior grau de abstração e de sub-rogação. É possível que a função do gene divergiu suficientemente para enfraquecer a semelhança fenotípica entre modelo e true fenótipo, ou fisiologia do peixe-zebra que inerentemente complica os efeitos da doença induzida. Nesses casos, sugerimos posterior dissecação do fenótipo produzido antes da demissão. Nós produzimos alguns exemplos bem sucedidos em que os fenótipos problemáticas para este ensaio foram modelados em embriões de peixe-zebra. Por exemplo, as mutações em TCF8, um gene associado com a distrofia de Fuchs córnea (FCD), foram testadas usando o nosso protocolo usando defeitos gastrulação como uma leitura fenotípica substituto base nas funções conhecidas desta transcrição no início do desenvolvimento 29 Em outros casos, por exemplo. como a distrofia muscular em adultos causada por mutações em DNAJB6, fomos capazes de gerar fenótipos myofiber em embriões 5dpf apesar do fato de que os seres humanos são desprovidos de massa muscular apreciável patologia em seus primeiros três a quatro décadas de vida. 19
Além dos modelos aqui apresentados mutantes transientes, outros também tomaram vantage deste sistema transiente para modelar doenças humanas numa variedade de sistemas do corpo. Num exemplo, retinite pigmentosa foi modelada em peixes-zebra por o knockdown da RP2 gene, resultando em morte celular e diminuição da retina laminação da retina. Recuperação com ARNm humano de tipo selvagem resultou no desenvolvimento de todas as três camadas da laminação da retina, enquanto que quatro de cinco ARNm mutantes não conseguiram resgatar 30. Embora este modelo de um distúrbio sensorial humana baseia-se num fenótipo morfológico, também é possível ensaio resposta a estímulos tais como alarme sonoro ou inibição pré-pulso 47.
Recentemente, um modelo de peixe-zebra foi utilizada para investigar a patogênese da doença de Alzheimer através da proteína precursora de amilóide. 31 Os autores mostraram que o gene knockdown causado prejudicada crescimento axonal dos neurônios motores, que poderiam ser resgatados com mRNA humano. Esse modelo provou ser especialmente informativos, como modelos de mouse exibir apenas phenot sutilIPOS (único knockdown) ou letalidade pós-natal (double knockdown). A capacidade de avaliar os embriões de peixe-zebra in vivo ao longo do desenvolvimento ajudou a discernir o efeito patogénico de redução da proteína precursora amilóide, bem como a prova directa, desde que a proteína requer tanto um domínio extracelular e intracelular para um funcionamento adequado. Outros modelos notáveis incluem o de distrofias musculares adicionais 32, Diamante Blackfan anemia 33, síndrome Axenfeld-Reiger (desenvolvimento ocular e craniofacial) 34, doença inflamatória intestinal 35 (atividade antibacteriana), doença de Parkinson 36 (neurônio e perda de locomoção), e apreensão de 37 (hidrocefalia e hiperatividade).
O mais comum são as linhas mutantes de peixe-zebra que foram mostrados também recapitular um fenótipo da doença humana. Avaliado em 1,38, os modelos incluem leucemia, melanoma, cardiomiopatias dilatadas, a distrofia muscular de Duchenne,e muitos outros.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos o apoio do Verão Research Fellowship a Duke University Dean (AN), American Heart Association (AHA) comunhão 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) concede R01-EY021872 do National Eye Institute (EED), R01HD04260 do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento (NK), R01DK072301 e R01DK075972 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas renais (NK), e da União Europeia (Financiado pelo 7 º Programa-Quadro da UE sob GA nr 241955, projeto SYSCILIA;. EED, NK) NK é um Distinguished Jean e George W. Brumley Professor.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |