כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש וספציפי<em> In vivo</em> מבחני לפרשנות שונים בהפתולוגיה אנושית. מניפולציה גנטית חולפת דרך microinjection של mRNA האנושי וWT מוטנט וoligonucleotides (MO) morpholino antisense לרתום נהילות של דג הזברה מתפתח עובר במהירות מוטציות assay פתוגניים, במיוחד, אך לא רק, בהקשר של הפרעות התפתחותיות אדם.
כאן, אנו מציגים שיטות לפיתוח מבחני לבצע שאילתות שינויי nonsynonymous פוטנציאל קליני משמעותיים בשימוש בשלמת vivo בדג הזברה. הזברה (Danio rerio) הן מערכת חיה שימושית בשל נהילות הניסיונית שלהם; עוברים הם שקופים כדי לאפשר צפייה קלילה, עובר vivo לשעבר ההתפתחות המהירה, ניתן להשפיע גנטי 1 היבטים אלו אפשרו להתקדמות משמעותית בניתוח של עובר,. תהליכים מולקולריים, והמוךפו"גנטי איתות. יחדיו, את היתרונות של מודל חוליות זו להפוך דג הזברה נוחה מאוד לדוגמנות הפגמים התפתחותיים במחלה בילדים, ובמקרים מסוימים, הפרעות במבוגרים. כי הגנום דג הזברה הוא שמור ביותר עם זה של בני אדם (~ 70% orthologous), ניתן לשחזר מצבי מחלה אדם בדג הזברה. מטרה זו מושגת גם באמצעות ההזרקה של מוטציה אנושית מ 'RNA כדי לגרום לעלייה בדומיננטי שלילית או של אללים פונקציה או ניצול של oligonucleotides (MO) morpholino antisense לדכא גנים לחקות אובדן גרסאות פונקציות. באמצעות שלמה של פנוטיפים-Induced MO עם mRNA האנושי כתרים, הגישה שלנו מאפשרת פרשנות של ההשפעה המזיקה של מוטציות ברצף חלבון אנושי המבוסס על יכולתו של ה-mRNA מוטציה להציל את הפנוטיפ מדידה, רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מודלים של אללים המחלה האנושיים מתרחש באמצעות microinjection של עוברי דג הזברה עם מ.ו. ו / או mRNA האנושי בשלב תא 1-4, וphenotyping עד שבע ימים לאחר הפריה (DPF). אסטרטגיה כללית זו ניתנת להארכה למגוון רחב של מחלות פנוטיפים, כפי שמודגם בפרוטוקול הבא. אנו מציגים מודלים הוקמו למוךפו"גנטי איתות, יושרת craniofacial, לב, כלי דם, תפקוד כליות, ופנוטיפים הפרעת שריר שלד, כמו גם לאחרים.
הפרשנות הפונקציונלית של מידע גנטי והמחאת הערך הקליני החזוי לגנוטיפ מייצגת בעיה עיקרית בגנטיקה רפואית, והוא הופך יותר ויותר נוגע ללב עם ההיתכנות הטכנית וכלכלית המואצת של רצף הגנום כולו. לכן, יש צורך לפתח וליישם פרדיגמות חדשות כדי לבדוק את pathogenicity של גרסאות שונות של משמעות לא ידועה (ואס) זוהו בחולים. לאחר מכן מבחני אלה חייבים להיות מדויקים, בזמן ויעיל וחסכוניים, ובנמל הפוטנציאל לזרז מעבר לתועלת קלינית.
בעוד בעכבר באופן מסורתי את הכלי של בחירה בתחום דוגמנות מחלה אנושית, דג הזברה הם מתעוררים כתחליף מדעי והוגן מבחינה כלכלית. שלא כמו בעכבר, ביולוגיה דג הזברה מאפשרת גישה נוחה ומהירה לכל השלבים ההתפתחותיים, בסיוע של עוברי בהירות אופטית המאפשרת הדמיה בזמן אמת של פתולוגיות מתפתחות. <sup> 1 הדור החדש יחסית של דג הזברה קווים מוטנטים סיפקה בדיקות נוספות ואפשרויות דוגמנות, מועסקות על ידי רבים במחקרים פונקציונליים, אך טכנולוגיה זו ממשיכה להיות מוגבלת (הנסקרת ב 1,38). לא רק שמוטציות גנטיות עם דפיקה תוספות של מוטציות ספציפיות מייגע כדי להשיג, הם גם לא נוחים לניתוח בינוני או תפוקה גבוהה לבדיקה של מגוון רחב של מוטציות בתוך גן יחיד. חשוב לציין, חבילה אחת של בדיקות יכולה לספק מידע לא רק לפוטנציאל הפתוגני של אללים, אלא גם לכיוון של השפעה ברמה התאית (למשל אובדן התפקוד לעומת רווח של פונקציה), שהוא קריטי ליידוע מצב של ירושה במשפחות, במיוחד כאשר שושלות יוחסי אדם קטנות נמל מידע מוגבל על המצב של העברת גנטית. לשם השוואה נוספת של את השימושים של עכבר זמין ודגמי דג הזברה, ראה טבלת מס '1.
אנחנו גם לציין כימחדש הם מגבלות מובנות למערכת מודל דג הזברה. למרות ד לי rerio פיתוח ראשוני מהיר של מערכות איברים, לבגרות מינית דורשת כשלושה חודשים. בגלל זה, הפרעות טרום לידתי וילדים הופעה הן נוחות ביותר למודל זה ביטוי חולף. בעוד אידיאלי לביצוע מסכי תרכובת כימית גדולים, השימוש של מוטציות גנטיות הוא לא ריאלי עבור הבדיקה השיטתית של אלפי גרסאות nonsynonymous שתורמות, וימשיך להיות מזוהים בהפרעות ילדים.
בדיקות השלמה מתוארות כאן לנצל את העקיבות הזו, רמה הגבוהה של הומולוגיה, ושימור של תפקוד בין חלבונים אנושיים ודג זברה, במיוחד כך למולקולות הנדרשות לתהליכים התפתחותיים משומרים. איור 1 מתאר את הבדיקות ואסטרטגיה לזיהוי השפעות אלל שונות. ניתן לבצע גם אובדן התפקוד (LOF) ומבחנים דומיננטיים. לLOF, הניסוי מתחיל עם הדיכוי של הגן של עניין עם מציאה morpholino, וassaying לפנוטיפים שעשויות להיות רלוונטית לפנוטיפ הקליני תחת חקירה. דיכוי ניתן להשיג גם על ידי חסימת תרגום על ידי מיקוד MO ליד או אתר תחילת translational של לוקוס דג הזברה (תרגום חוסם morpholino; tbMO) או על ידי הפרעה בשחבור על ידי הצבת MO בצומת אחוי, בדרך כלל או גרימת הכללתו של אינטרון או אקסון הסוטה דילוג (אחוי החסימה morpholino; sbMO).
כתוצאה מכך, ה-mRNA כתרים מהתמליל האנושי orthologous הוא הציג וההצלה כימות של הפנוטיפ נמדדת. ברגע שassay היא הוקם, יכולה להיות הציגה מוטציות מועמד במסר האנושי וassayed ביכולתם כדי להציל את הפנוטיפ-Induced MO באותה היעילות כמו ה-mRNA האנושית WT. לעומת זאת, למועמד אללים דומיננטיים, mRNA האנושי (אבל לא MO) הוא introducאד עם ציפייה שmRNA האנושי WT לא גס להשפיע אנטומיה ופיזיולוגיה דג הזברה, ואילו כניסתה של בדיקת מוטציות שיש לו השפעה דומיננטית תהיה לגרום לפנוטיפים דומים לאלה שנצפו בתנאים הקליניים בבני האדם. ניסוי זה יכול להיות עוד יותר פרטנית לנתח אם האפקט הדומיננטי מתרחש על ידי רווח של פונקציה (GOF) או מנגנון דומיננטי שלילי על ידי מיזוג mRNA האנושי WT ומוטציה; לאירועי GOF, תוספת של ה-mRNA האנושית WT צפוי להיות רלוונטי, ואילו עבור אללים דומיננטיים שליליים, מיזוג של mRNA WT מוטנט וצריך לשנות את חומרת הפנוטיפ הנגרם על ידי מסר מוטציה. בכל המקרה, אנו ממליצים שכל שילובים של זריקות (MO עם mRNA האנושי WT לעומת morpholino עם מוטציה אנושית וכו 'mRNA להתבצע, רצוי בתוך אותו המצמד של עוברים (ראה איור 1) פרשנות היא כדלקמן.:
לבדיקות LOF:
לבדיקות דומיננטיות:
תכנית מגירה:
השיטות שתוארו כאן מייצגים פרוטוקול כללי החלים על assay של שינויי nonsynonymous קשורים למגוון של פנוטיפים מחלה גנטיים אנושיים (טבלה 2, איור 3). הגישות שלנו הוכיחו שימושיות כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של וריאציה על פנוטיפים מחלה, ועל מנת לסייע לנתח מנגנוני מחלה (כגון תרומה של מוטציות שליליות דומיננטיות לתסמונת Bardet-Biedl, הפרעה בעיקר 17 אוטוזומלית רצסיבית). נכון להיום, באמצעות הפיתוח של עץ ההחלטה שהוצג, יש לנו מודל בעלות סבירה וזמן העולה על 200 גנים הקשורים קשר סיבתי עם הפרעות גנטיות, לעודף של 1,000 אללים.
למרות שלא נדון בהרחבה כאן, יש לנו גם הראו כי שיטות אלה הן מתאימים למודל סוגים אחרים של נגעים גנטיים, כגון גרסאות של מספר עותקים (CNVs), כמו גם ואינטראקציות גנטיות. ניתוח של אירועים כאלה הם מעבר להיקף שלתיאור השיטה הנוכחי, למרות שהם ביסודו להסתמך על אותו העיקרון של בדיקה שיטתית של גני המועמדים (כולל זוגות של גנים שהוחדרו במקביל) כדי לקבוע אינדוקציה או החמרה של פנוטיפים קליני מתאימים. לדוגמה, כדי להבהיר שמתוך 29 גנים ב16p11.2 CNV יכול להיות רלוונטי לmicrocephaly הנצפה נצפה בחולים עם כפילויות של מקטע גנומי 660 KB, mRNAs המקביל לכל אחד מ29 גנים במיגזר הוזרקו וראש מדידות גודל נערכו ב2 DPF ו5 DPF, חושפות את התרומה עיקרית של תעתיק יחיד, KCTD13. 21 בנוסף, יש לנו להשתמש במודל זה כדי אינטראקציות גנטיות assay של נגעי גנומי בחולים עם תסמונת שניהם Bardet-Biedl ומחלת הירשפרונג. 22 על ידי השוואה של דיכוי MO מהגנים סיבתיים של שתי הזהויות הקליניות בנפרד ובו זמנית, שהיינו מסוגל לזהות את הפנוטיפ שנוצר כbeing אינטראקציה סינרגיסטית ולא רק חומרת תוסף.
למרות שהוקם רגישות גבוהה (98%) וסגוליות (> 82%) לגרסות התורמים לciliopathies 17, אין לנו עדיין מספיק נתונים כדי לקבוע אם אלה הם להכליל את כל readouts פנוטיפי במודלים של דג הזברה. לשם כך, מספר גדול של אללים, חזה גנטי להיות או שפיר או פתוגניים, חייב להיבדק בתוך כל קטגוריה פנוטיפי. זה יהיה חשוב במיוחד לביצוע מבחני כאלה בהגדרה הקלינית, שבו פרשנות פונקציונלית של VUSs יכול להודיע אבחון וניהול רק אם הבנה חזקה של תוצאות חיוביות שגויות וגם שליליים שווא יכולה ללוות את המסירה של תוצאות כאלה לרופאים וחולים. עם זאת, שיטות אלה יכולים לתרום באופן משמעותי לכיוון הבנה טובה יותר של הנוף של מחלה גנטית אנושית. אנו צופים כי מודלים אלה לא רק לשמש כfounשעשועים לפרשנות משופרת של מידע גנטי קליני, אלא גם להיות מועסקים כמודלים שימושיים לנהל מסכי טיפוליים. בנתונים vivo יכול להיות גם בהשוואה לתחזיות חישוביות סיליקו ממקורות כגון PolyPhen 23, לנפות 24, SNPs & Go 25, או MutPred 26 כדי להראות התאמה. שימו לב כי במחקר קודם של חיזוי מסדי נתונים SNPs & Go וMutPred נמצאו להיות מדויק ביותר, עם דיוקים להגיע רק 0.82 ו 0.81, בהתאמה. 27
אמנם יש לנו התווינו את החוסן של שיטות אלה לקבוצת משנה של מומים אנטומיים ילדים (טבלת 2, איור 3), פנוטיפים מסוימים הם פחות צייתנים בשיטות אלה. על אף חריגים מסוימים, ישנם שלושה סוגים עיקריים של הפרעות לא מקובל הפרוטוקול שלנו. הפרעות מבוגרי תחילה (כגון מחלת פרקינסון) מהוות אתגר למודל במערכת עוברית. להאט פרוגפנוטיפים ניווניות ression (כגון דמנציה frontotemporal) עשויים לדרוש יותר זמן מאשר חלון DPF שבע פעילות MO לייצר פנוטיפ. טכנולוגיות מציאה גן אחרות כגון RNAi וsiRNA זמינים כדי להפריע או לבזות את יעד הגן, אבל זה הוכח שאף אחד ספציפי כ, יציב, שאינו רעיל, או ארוך טווח כחודש 28, ובכך גם הגבלת הזמן עבור phenotyping. שלישית, כמה מבנים בעלי חוליות, כגון ריאות של יונקים, אין לי מבנה מספיק orthologous בעובר דג הזברה. יש לנו גם סיפק הציעה תכנית מגירה לחקירה של מקרים בם הזרקת mRNA האנושית WT מובילה לפנוטיפ, למרות שאנו מזהירים זה הוא מצב חריג ולא רצוי.
אז פנוטיפים מחלות מסוימים עשויים לדרוש מידה רבה יותר של הפשטה ופונדקאות. יתכן כי תפקוד גן כבר התפצל מספיק כדי להחליש את הדמיון פנוטיפי בין המודל וtrהפנוטיפ UE, או שדג זברת הפיסיולוגיה מיסודו מסבכת את ההשפעות של המחלה המושרית. במקרים כאלה, אנו ממליצים לנתיחה נוספת של הפנוטיפ הופק לפני הפיטורים. יש לנו יצרנו כמה דוגמאות מוצלחות שבי פנוטיפים בעייתיים עבור assay זה כבר דגם בעוברי דג הזברה. לדוגמה, מוטציות בTCF8, גן הקשור למחלת ניוון קרנית פוקס (FCD), היו assayed באמצעות הפרוטוקול שלנו על ידי שימוש בפגמי gastrulation כreadout פנוטיפי פונדקאית מבוסס על התפקידים הידועים של תמליל זה בהתפתחות מוקדמת. -29 במקרים אחרים, כגון כניוון שרירי מבוגרים תחילת נגרמת על ידי מוטציות בDNAJB6, שהיינו מסוגל לייצר פנוטיפים myofiber בעוברי 5dpf למרות העובדה שבני האדם הם חסרים שרירים ניכר פתולוגיה בשלושה עד ארבעה העשורים הראשונים לחייהם. 19
בנוסף לדגמי מוטציה החולפים שהוצגו כאן, אחרים לקחו גם AdvantaGE של מערכת חולפת זו למודל מחלה אנושית במגוון רחב של מערכות גוף. בדוגמה אחת, רטיניטיס פיגמנטוזה היה במתכונת בדג זברה על ידי מציאה של RP2 הגן, וכתוצאה מכך המוות של תאי רשתית וירידה בלמינציה רשתית. הצלה עם mRNA פראי סוג האנושי הביאה לפיתוח של כל שלוש השכבות של למינציה רשתית, ואילו ארבע מתוך חמש mRNAs מוטציה לא הצליחו להציל. אף 30 מודל זה של הפרעה חושית אנושית מבוסס על פנוטיפ מורפולוגי, הוא גם ניתן תגובת assay לגירויים כגון הלה אקוסטית או Prepulse עיכוב 47.
לאחרונה, מודל דג הזברה היה בשימוש כדי לחקור את היווצרות המחלה אלצהיימר באמצעות חלבון מקדים עמילואיד. 31 החוקרים הראו כי מציאה הגן גרמה תולדת axonal לקויה של תאי עצב מוטורי, שניתן היה להציל עם mRNA האנושי. המודל הזה הוכיח את עצמו במיוחד אינפורמטיבי, כמודלים עכבר להציג רק phenot העדיןypes (מציאה יחידה) או קטלני לאחר לידה (מציאה כפולה). היכולת להעריך את עוברי דג הזברה in vivo לאורך פיתוח סייעה להבחין אפקט הפתוגני של חלבון עמילואיד מבשר מופחת, כמו גם עדות ישירה ובלבד שהחלבון דורש גם תחום תאי ותוך תאים לתפקוד תקין. דגמים בולטים אחרים כוללים זה של ניוון שרירים נוסף 32, 33 היהלומים Blackfan אנמיה, Axenfeld-Reiger תסמונת (פיתוח עיני וcraniofacial) 34, מחלות מעי דלקתיות 35 (פעילות נגד חיידקים), מחלת פרקינסון (36 נוירון ואובדן תנועה), ותפיסה 37 (הידרוצפלוס והיפראקטיביות).
נפוץ יותר הם קווי דג הזברה מוטציה אשר הוכחו לשחזר פנוטיפ מחלה אנושי גם. נבדקו ב1,38, דגמים כוללים לוקמיה, מלנומה, cardiomyopathies המורחבים, ניוון שרירים דושן,ועוד רבים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים תמיכה מהקיץ מחקר המלגה של אוניברסיטת דיקן דוכס (), איגוד לב האמריקאי (AHA) מלגת 11POST7160006 (CG), המכונים הלאומי לבריאות (NIH) מענקי R01-EY021872 מהלאומי Eye Institute (EED), R01HD04260 מ המכון הלאומי לבריאות ילד והתפתחות (נ"ח), וR01DK072301 R01DK075972 מהמכון הלאומי לסוכרת והפרעות עיכול כליות (נ"ח), והאיחוד האירופי (ממומן על ידי האיחוד האירופי 7 ה FP תחת GA ע"נ 241,955, פרויקט SYSCILIA;. EED, נ"ק) NK הוא ז'אן נכבד וג'ורג' וו Brumley פרופסור.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |