Um ensaio de parasita resgate e transformação com células infectadas THP1<em> In vitro</em> Com<em> Leishmania donovani</em> Foi otimizado para anti-leishmaniose triagem de drogas. O ensaio envolve a diferenciação de células THP1, a infecção com promastigotas, o tratamento com medicamentos de teste, na lise controlada dos macrófagos infectados, resgate de amastigotas, transformação de promastigotas e crescimento e proliferação de promastigotas de monitorização com um ensaio fluorimétrico.
A leishmaniose é uma das doenças mais negligenciadas do mundo, em grande parte afetando os mais pobres dos pobres, principalmente em países em desenvolvimento. Mais de 350 milhões de pessoas são consideradas em risco de contrair a leishmaniose, e cerca de 2 milhões de novos casos ocorrem um ano. Leishmania donovani é o agente causador da leishmaniose visceral (LV), a forma mais fatal da doença. A escolha de drogas disponíveis para tratar a leishmaniose é limitada 2; tratamentos actuais proporcionam uma eficácia limitada e muitos são tóxicos nas doses terapêuticas. Além disso, a maioria das drogas de primeira linha de tratamento já perderam a sua utilidade, devido ao aumento da resistência a múltiplas drogas 3. O gasoduto atual de anti-Leishmania drogas também é severamente reduzida. São necessários esforços continuados para enriquecer um novo anti-leishmaniose oleoduto de descoberta de drogas, e este esforço depende da disponibilidade de modelos adequados de rastreio in vitro.
<p class = "jove_content"> Em promastigotas in vitro e ensaios 4 axênicas amastigotas cinco são utilizados principalmente para anti-leishmaniose triagem de drogas no entanto, pode não ser adequado devido a importantes celulares, diferenças fisiológicas, bioquímicas e moleculares em comparação com amastigotas intracelulares. Ensaios com macrófagos amastigotas modelos são considerados mais próximo das condições fisiopatológicas de leishmaniose, e são, portanto, o mais apropriado para a avaliação in vitro. Diferenciadas, não-humanos que dividem as células de leucemia aguda monocíticas (THP1) (faça um atraente) Em alternativa à isoladas macrófagos primários e podem ser utilizados para ensaiar a actividade anti-Leishmania de diferentes compostos contra amastigotas intracelulares.Aqui, apresentamos um ensaio parasita resgate e transformação com diferentes THP1 células infectadas in vitro com Leishmania donovani para a seleção de compostos puros e naturais prodtos extractos e determinação da eficácia contra as formas amastigotas de Leishmania intracelulares. O ensaio envolve os seguintes passos: (1) a diferenciação de células THP1 em que não se dividem macrófagos, (2) a infecção de macrófagos com L. donovani promastigotas metacíclicas, (3) tratamento de células infectadas com os medicamentos de teste, (4) a lise controlada de macrófagos infectados, (5) A libertação / salvamento de amastigotas e (6) transformação de formas amastigotas de promastigotas vivos para. O ensaio foi optimizada utilizando tratamento com detergente para a lise controlada de infectados por Leishmania THP1 células para alcançar salvamento quase completa de formas amastigotas viáveis com um efeito mínimo sobre a sua capacidade de transformar a promastigotas. Macrófagos diferentes relações entre promastigotas foram testados para alcançar infecção máxima. Quantificação da infecção foi realizada por meio da transformação de vida, resgatados Leishmania amastigotas para promastigotas e avaliação de seu crescimento por uma alamarBlue ensaio fluorométrico, em microplacas de 96 poços. Este ensaio é comparável ao actualmente usado microscópico gene repórter, transgénicos e digitais-imagem ensaios de análise. Este ensaio é robusto e mede apenas os amastigotas intracelulares vivos em relação ao gene repórter e ensaios de análise de imagem, que não podem diferenciar entre os amastigotas vivos e mortos. Além disso, o ensaio foi validado com um painel de corrente de anti-Leishmania drogas e tem sido aplicado com sucesso em grande escala de triagem de compostos puros e de uma biblioteca de fracções de produtos naturais (Tekwani et al. Não publicado).
Há vários métodos disponíveis para os anticorpos anti-leishmaniose triagem de drogas baseadas em macrófagos amastigotas modelos. Os ensaios podem ser feitos com os macrófagos obtidos a partir de animais hospedeiros células de exsudado peritoneal (PEC nomeadamente), células de monócitos do sangue periférico (PBMC) de 6 ou derivadas da medula óssea (BMM macrófagos) ou em linhas de células monocíticas, tais como o rato (J774 e RAW264.7 ) 7 e humano (THP1, U937, HL-60) 8 células monocíticas. Os ensaios, que utilizam células de divisão de acolhimento, deve assegurar que os efeitos de confusão da atividade de drogas em ambos parasita e hospedeiro número de células são consideradas. Os macrófagos diferenciados primários coletados de várias fontes, tais como camundongos e ratos são não-divisão na natureza, mas estas preparações celulares não pode ter populações de células homogêneas. As linhas de células monocíticas células-derivados são homogéneas na natureza e são um melhor modelo para a despistagem de macrófagos-amastigota-baseado. Fora de diferentes linhas de células monocíticas, diferentiated THP1 células (linha de células humanas de leucemia monocítica aguda) pode formar uma monocamada não estão em divisão e oferecem uma alternativa atraente aos macrófagos isolados primários.
O rastreio de macrófagos-amastigota baseada pode ser feito de várias maneiras. Avaliação microscópica clássica, baseada em célula direta e parasita contando 9 é um trabalho intensivo. A ausência de automação limita a utilidade deste ensaio. Contagem de células é demorado e pode dar determinação imprecisa de valores de IC50 desde determinação da viabilidade do parasita por meio de um procedimento de coloração é difícil. Muitos corantes fluorescentes e os anticorpos monoclonais podem ser utilizados para ensaios de citometria de fluxo 10, 11, mas estes testes também são limitados devido à menor sensibilidade e limitação do intervalo de tempo de fármaco para o tratamento de apenas um dia. Existem vários ensaios reporter genes disponíveis para quantificar o crescimento de formas amastigotas 12,13,14. Uma máquina automáticaed rastreio pode ser possível usando genes repórter, mas estes testes também têm certas desvantagens. Primeiro, a maioria destes ensaios necessitam de selecção de drogas para a manutenção da expressão epissómica dos genes repórter, o que pode não ser ideal para uma experiência de rastreio de drogas. A maneira pela qual o gene repórter é introduzido também podem influenciar as propriedades fisiológicas do parasita e têm um impacto sobre a triagem. Se o gene repórter é a parte de um plasmídeo epissómico, a saída relativa do repórter pode depender do número de cópias do plasmídeo transfectado (que varia de célula para célula), em vez de sobre a actividade do fármaco 14. Alguns parasitas repórter que são transformados parasitas não precisa de manter a pressão selectiva no gene repórter, no entanto, pode haver consequências biológicas ou por ruptura da arquitectura genómica ou apenas pela presença das proteínas repórter estranhos 15. Em alguns ensaios de gene repórter com base, existemquestões de sensibilidade e de fundo atividade 16. Mais importante, muitos dos ensaios de expressão do gene repórter, especialmente uma com a GFP repórter gene15, não podem diferenciar entre os amastigotas intracelulares vivos e mortos. Ensaios baseados em genes repórter da luciferase pode discernir entre vivas e mortas formas amastigotas, mas o substrato e tampão de lise de células para esses ensaios são caros em grande escala de triagem 17. Para superar estes deméritos e as limitações de anteriores ensaios de rastreio para macrófagos amastigota-based, temos desenvolvido e optimizado neste ensaio parasita salvamento e de transformação. Este ensaio baseia-se em células THP1, que têm boa homogeneidade e são não se dividem na natureza, como células hospedeiras.
O ensaio Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio aqui descrito é comparável ao ensaio baseado em Digital-Análise de Imagens-Direct-Contagem de amastigotas intracelulares. Microscopia de fluorescência e DIC, digital imagAs análises de e por ImageJ para contagem diferencial dos núcleos de macrófagos e os núcleos do parasita ainda mais refinado o ensaio de contagem, ao microscópio. Capturar as imagens em filtros de luz fluorescente e contraste de interferência diferencial (DIC) filtros melhoraram a qualidade da imagem digital para a contagem mais precisa dos parasitas intracelulares. Tanto imagens fluorescentes e DIC podem ser fundidas para obter as imagens digitais com contornos claros de macrófagos celulares e núcleos intracelular fluorescente. Os núcleos dos macrófagos e os núcleos parasita pode ser diferencialmente reconhecido com ImageJ. Portanto, tanto o Digital-Análise de Imagens-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio têm o potencial para automação e aplicação em larga escala de triagem. Os passos críticos na Parasite-Rescue-Transformação Assay-se: (a) as lavagens repetidas de culturas de células THP1 após a exposição a formas promastigotas de Leishmania, para assegurar a remoção quase completa do estágio não-promastigotas institucionalizados e (b) a lise controlada das células infectadas com SDS THP1. Ambas as etapas podem também ser controlados com a automatização e não deve comprometer a taxa de transferência do ensaio. O segundo passo de lavagem, após a exposição das células infectadas por Leishmania THP1 para os medicamentos de teste / compostos remove os restantes não internalizadas parasitas, se houver. O Parasite-Rescue-Transformação Assay oferece vantagens significativas sobre os existentes gene repórter microscópico, e ensaios de análise de imagem. O ensaio é simples, robusta e reproduzível, pode ser automatizado de grande escala de triagem e, portanto, deve ter importante aplicação na triagem de grandes bibliotecas de compostos para a descoberta de novos medicamentos anti-leishmaniose. Além disso, o ensaio também pode ser aplicado para avaliar a infectividade do clínico, assim como, os isolados laboratoriais de Leishmania in vitro.
The authors have nothing to disclose.
O NCNPR-USDA-ARS acordo Científico Não. 58-6408-2-0009; CDMRP Prêmio concessão # W81XWH-09-2-0093 pelos EUA investigação médica do Exército e Comando de Material.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | コメント |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 |