Ein Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay mit THP1 Zellen infiziert<em> In vitro</em> Mit<em> Leishmania donovani</em> Hat für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening optimiert. Der Test beinhaltet Differenzierung THP1 Zellen, Infektion mit Promastigoten Behandlung mit Testarzneimitteln, kontrollierte Lyse der infizierten Makrophagen, Rettung Amastigoten, Umwandlung in Promastigoten und Überwachung promastigote Wachstum und die Vermehrung mit einem fluorimetrischen Assay.
Leishmaniose ist eine der weltweit am meisten vernachlässigten Krankheiten, vor allem Auswirkungen auf die Ärmsten der Armen, vor allem in den Entwicklungsländern. Über 350 Millionen Menschen sind gefährdet, sich mit Leishmaniose angesehen, und rund 2 Millionen neue Fälle auftreten, jährlich 1. Leishmania donovani ist der Erreger für die viszerale Leishmaniose (VL), die meisten tödlichen Form der Krankheit. Die Auswahl der Medikamente zur Behandlung von Leishmaniose ist begrenzt 2; aktuellen Behandlungen bieten begrenzte Wirksamkeit und viele sind giftig in therapeutischen Dosen. Darüber hinaus haben die meisten der First-Line Behandlung Medikamente bereits ihren Nutzen durch die zunehmende multiple drug resistance 3 verloren. Die aktuelle Pipeline von Anti-Leishmania Medikamenten ist ebenfalls stark dezimiert. Nachhaltige Anstrengungen sind nötig, um ein neues Anti-Leishmania Wirkstoffforschung Pipeline zu bereichern, und dieses Bestreben beruht auf der Verfügbarkeit von geeigneten in vitro-Screening-Modelle.
<p class = "jove_content"> In vitro Promastigoten 4 und axenischen Amastigoten Assays 5 sind in erster Linie für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening verwendet jedoch möglicherweise nicht geeignet wegen erheblicher zellulären, physiologischen, biochemischen und molekularen Unterschiede im Vergleich zu intrazellulären Amastigoten. Assays mit Makrophagen-Amastigoten Modelle sind als am nächsten zu den pathophysiologischen Bedingungen der Leishmaniose und sind daher die am besten geeignete für die in vitro-Screening. Differenzierte, nicht teilende menschliche akuten monozytären Leukämie-Zellen (THP1) (eine attraktive) Alternative zu isolierten primären Makrophagen und können zum Testen anti-Leishmania Aktivität verschiedener Verbindungen gegen intrazelluläre Amastigoten verwendet werden.Hier präsentieren wir ein Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay mit differenzierten THP1 Zellen in vitro mit Leishmania donovani für das Screening von reinen Verbindungen und Naturstoffen infiziertdukten Extrakte und Bestimmen der Wirksamkeit gegen die intrazelluläre Leishmania Amastigoten. Der Assay umfasst die folgenden Schritte: (1) die Differenzierung von THP1-Zellen, nicht teilende Makrophagen, (2) Infektion von Makrophagen mit L. donovani metazyklische Promastigoten, (3) Behandlung von infizierten Zellen mit Testarzneimitteln, (4) kontrollierte Lyse von infizierten Makrophagen (5) release / Rettung Amastigoten und (6) Umwandlung von Live Amastigoten um Promastigoten. Der Assay wurde unter Verwendung optimierter Detergensbehandlung zur kontrollierten Lyse von Leishmania-infizierten THP1-Zellen eine nahezu vollständige Rettung lebensfähiger intrazellulären Amastigoten mit minimalen Auswirkungen auf ihre Fähigkeit, an Promastigoten Transformation zu erreichen. Verschiedene Makrophagen: Promastigoten Verhältnisse wurden getestet, um maximale Infektion zu erreichen. Die Quantifizierung der Infektion durch die Transformation von Live durchgeführt wurde, Amastigoten geretteten Leishmania um Promastigoten und Auswertung ihres Wachstums durch eine alamarBlue fluorimetrischen Assay in 96-Well-Mikroplatten. Dieser Assay ist vergleichbar mit dem gegenwärtig verwendeten mikroskopische, transgene Reportergen und digitale Bildanalyse-Assays. Dieser Assay ist robust und misst nur die Live intrazellulären Amastigoten Vergleich zu Reportergen und Bildanalyse-Assays, die nicht zwischen lebenden und toten Amastigoten kann differenzieren. Außerdem wurde der Test mit einem aktuellen Panel von Anti-Leishmania Medikamente validiert und wurde erfolgreich auf gross angelegte Screening von reinen Verbindungen und eine Bibliothek von Naturprodukten Fraktionen (Tekwani et al. Unveröffentlicht) angewendet.
Es gibt mehrere Methoden zur Verfügung für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening auf Makrophagen-amastigote Modellen. Assays können mit den Makrophagen von Wirtstieren gesammelt nämlich Peritonealexsudat-Zellen (PEC), periphere Blutmonozyten (PBMC) erfolgen 6 oder Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMM) oder in monozytischen Zelllinien wie Maus (J774 und RAW264.7 ) 7 und menschliche (THP1, U937 und HL-60) 8 monozytären Zellen. Die Assays, die Teilung Wirtszellen verwenden, müssen sicherstellen, dass die verwirrende Auswirkungen von Drogen-Aktivität auf beiden Parasiten und Wirtszellen Zahl betrachtet werden. Die differenzierten primären Makrophagen aus verschiedenen Quellen, wie Mäusen und Ratten gesammelt sind nicht teilende in der Natur, aber diese Zellpräparationen möglicherweise keine homogene Zellpopulationen. Monozyten-abgeleitete Zellinien sind homogen in der Natur sind und ein besseres Modell für die Makrophagen-Amastigoten-basierten Screening. Aus verschiedenen monozytären Zelllinien, unterschiedrentiated THP1 Zellen (menschliche akuten monozytären Leukämie-Zelllinie) können eine nicht-teilenden Monoschicht und bieten eine attraktive Alternative zur primären isolierten Makrophagen.
Die Makrophagen-Amastigoten-basierten Screening kann auf verschiedene Arten erfolgen. Klassische mikroskopische Auswertung der direkten Zell-und Parasiten Zählen 9 basiert, ist arbeitsintensiv. Das Fehlen der Automatisierung begrenzt die Nützlichkeit dieser Assay. Zählen von Zellen ist zeitaufwendig und kann zu ungenauen Bestimmung der IC 50-Werte, da die Bestimmung von Parasiten Lebensfähigkeit durch eine Färbung zu geben, ist schwierig. Viele Fluoreszenzfarbstoffe und monoklonale Antikörper können für die durchflusszytometrische Assays 10, 11 eingesetzt werden, aber diese Assays sind ebenfalls aufgrund der geringeren Empfindlichkeit und Begrenzung des Zeitintervalls von Arzneimittel-Behandlung, um nur einen Tag beschränkt. Es gibt mehrere verfügbare Reportergenassays zur Quantifizierung des Wachstums von intrazellulären Amastigoten 12,13,14. Ein Automated Screening kann möglich sein, mit Reportergene, aber diese Tests auch gewisse Nachteile. Erstens erfordern Mehrzahl dieser Assays Wirkstoffselektion zum Aufrechterhalten der episomalen Expression der Reportergene, die möglicherweise nicht ideal für ein Wirkstoffscreening Experiment. Der Weg, um den der Reportergen eingeführt könnte auch Einfluss auf die physiologischen Eigenschaften der Parasiten und haben einen Einfluss auf die Screening. Wenn der Reporter-Gen ist der Teil von einem episomalen Plasmid kann die relative Leistung von Reportergen über die Kopienzahl des transfizierten Plasmid (die je von Zelle zu Zelle) anstatt auf die Aktivität des Medikaments 14 abhängen. Einige Reporter Parasiten, die transformierten Parasiten brauchen keine selektive Druck, um das Reportergen zu halten sind, aber es könnte biologischen Folgen entweder durch Unterbrechung der genomischen Architektur oder nur durch die Anwesenheit der fremden Reporterproteine 15. In einigen Reportergen basierten Assays bestehenFragen der Empfindlichkeit und Hintergrund-Aktivität 16. Am wichtigsten ist, können viele der Reportergenexpression Assays, besonders diejenige mit GFP-Reporter gene15, nicht zwischen den lebenden und toten intrazellulären Amastigoten differenzieren. Assays auf Luciferasereportergens Basis kann zwischen lebenden und toten intrazellulären Amastigoten erkennen, aber Substrat und Zelllysepuffer für diese Assays sind für gross angelegte Screening-17 teuer. Um diese Nachteile und Einschränkungen der bisherigen Makrophagen-amastigote-basierte Screening-Assays zu überwinden, haben wir entwickelt und diesen Parasiten-Rettungs-und Transformations-Assay optimiert. Dieser Assay basiert auf THP1-Zellen, die eine gute Homogenität aufweisen und nicht-teilenden in der Natur, als Wirtszellen basiert.
Der Parasit-Rescue-Transformation-Assay-Test hier beschriebenen ist vergleichbar mit dem Assay auf Digital-Image-Analyse-Direct-Zählen der intrazellulären Amastigoten basiert. Leuchtstoff-und DIC-Mikroskopie, digitale image Analysen ImageJ für Differential Zählen der Makrophagen Kernen und den Parasiten Kerne haben ferner die mikroskopische Zählung Assay verfeinert. Aufnehmen der Bilder unter Fluoreszenzlicht Filter und Differential-Interferenz-(DIC)-Filter haben die Qualität des digitalen Bildes für eine genauere Zählung der intrazelluläre Parasiten verbessert. Sowohl fluoreszierenden und DIC Bilder können zusammengeführt, um die digitalen Bilder mit klaren Makrophagenzelllinie Umrisse und fluoreszierenden intrazellulären Kerne zu erhalten. Die Makrophagen Kerne und der Parasit Kerne unterschiedlich mit ImageJ erkannt werden. Daher müssen sowohl Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay das Potenzial für die Automatisierung und Anwendung in großem Maßstab Screening. Die kritischen Schritte in der Parasite-Rescue-Transformation-Assay sind: (a) wiederholtes Waschen des THP1 Zellkulturen nach Exposition mit Leishmania Promastigoten, eine nahezu vollständige Abtrennung der nicht-intern sicherzustellen,sierte Promastigoten und (b) gesteuerte Lyse der infizierten Zellen mit THP1 SDS. Sowohl die Schritte können auch mit Automatisierung gesteuert werden und sollten nicht mit den Durchsatz des Assays beeinträchtigen. Der zweite Schritt der Wäschen nach der Exposition der Leishmania infiziert THP1-Zellen zu den Testarzneimitteln / Verbindungen entfernt die verbleibenden nicht internalisierten Parasiten, wenn überhaupt. Der Parasit-Rescue-Transformation-Assay bietet deutliche Vorteile gegenüber bestehenden mikroskopische Reportergen und Bildanalyse-Assays. Der Test ist einfach, robust und reproduzierbar, kann für eine groß angelegte Screening automatisiert werden und sollten daher wichtige Anwendung im Screening von großen Verbindungen Bibliotheken für neue Anti-Leishmania Wirkstoffforschung haben. Ferner kann der Assay auch zur Auswertung klinischer Infektiosität aufgebracht werden, sowie, Labor Isolate von Leishmania in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Die NCNPR-USDA-ARS Scientific Vereinbarung Nr. 58-6408-2-0009; CDMRP Gewährung Award # W81XWH-09-2 bis 0093 von der US Army Medical Forschung und Materiel Command.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | コメント |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 |