Паразита-спасательных и преобразование анализа с THP1 клеток, инфицированных<em> В пробирке</em> С<em> Leishmania donovani</em> Была оптимизирована для борьбы с leishmanial наркотиков отбора. Анализ включает в себя дифференциацию THP1 клеток, инфекция promastigotes, обработка тестов препаратов, контролируемых лизис инфицированных макрофагов, спасение amastigotes, переход к promastigotes и наблюдение за ростом и распространением промастиготы с флуорометрической анализа.
Leishmaniasis is one of the world’s most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).
Есть несколько методов, доступных для анти-leishmanial скрининга препаратов на основе макрофагов амастигота моделей. Анализы можно сделать с макрофагами, полученная от животных-хозяев именно перитонеального экссудата клетках (PEC), моноцитов периферической крови клеток (МПК) 6 или костного мозга макрофаги (БММ) или в моноцитарного клеточных линий, таких как мышь (J774 и RAW264.7 ) 7 и человека (THP1, U937, HL-60) 8 моноцитов клеток. Анализы, которые используют деление клеток-хозяев, должны гарантировать, что смешанное воздействие препарата деятельности на обоих паразитов и количество клеток-хозяев считаются. Дифференцированной первичной макрофаги, собранных из различных источников, таких как мыши и крысы не являются деления в природе, но эти клеточные препараты могут не иметь однородную клеточных популяций. Моноцитарного клеток-производных клеточных линий являются однородными по своему характеру и лучшие модели для макрофагов амастигота скрининг. Из различных клеточных линиях моноцитов, Diffrentiated THP1 клеток (моноцитов человека острую линию клеток лейкемии) могут образовываться без деления монослоя и предлагают привлекательную альтернативу первичной изолированной макрофагов.
Макрофагов амастигота скрининг можно сделать несколькими способами. Классическая микроскопической оценки основаны на прямом клеток и паразитов подсчета 9 является трудоемким. Отсутствие автоматизации ограничивает полезность этого анализа. Подсчет клеток занимает много времени и может дать неточные определения IC 50 значений, так как определение жизнеспособности паразитов через процедуру окрашивания трудно. Многие флуоресцентных красителей и моноклональные антитела могут быть использованы для проточной цитометрии анализа 10, 11, но эти анализы также ограничены из-за меньшей чувствительности и ограничение интервал времени с наркотиками лечение только один день. Есть несколько ген-репортер анализов доступны для количественного роста внутриклеточных amastigotes 12,13,14. Автоматред скрининга возможно с помощью репортер гены, но эти методы также имеют определенные недостатки. Во-первых, большинство из этих анализов требует выбор препарата для поддержания эписомные выражение репортер генов, которые не могут быть идеально подходит для экспериментов скрининг наркотиков. Путь, по которому репортер ген вводят также может влиять на физиологические свойства паразита и оказывать влияние на обследование. Если репортер ген является частью эписомные плазмиды, относительно выхода репортер может зависеть от числа копий плазмиды трансфицированных (которая варьирует от клетки к клетке), а не на активность препарата 14. Некоторые репортер паразитов, которые трансформируются паразиты не нужно селективного давления для поддержания ген-репортер, однако, не может быть биологические последствия либо, нарушая геномной архитектуры или просто присутствие чужеродных белков Репортер 15. В некоторых ген-репортер на основе анализов, естьвопросы чувствительности и фоновой активности 16. Самое главное, многие из корреспонденту экспрессии генов анализов, особенно один с GFP репортер gene15, не могут различать живые и мертвые внутриклеточных amastigotes. Анализы на основе гена люциферазы репортера и различать живые и мертвые внутриклеточных amastigotes, но подложкой и буфером для лизиса клеток для этих анализов дороги для крупномасштабного скрининга 17. Чтобы преодолеть эти недостатки и ограничения предыдущих макрофагов амастигота на основе скрининга, мы разработали и оптимизировать этот паразит-спасательных и преобразование анализа. Этот анализ основан на THP1 клетки, которые имеют хорошую однородность и без деления в природе, как клетки-хозяина.
Паразит-Rescue-Преобразование-анализа анализа, описанного здесь сравнимы с анализом на основе цифрового анализа изображений-Директ-счетной внутриклеточных amastigotes. Флуоресцентные и DIC микроскопии, цифровых мнимойэлектронной анализов ImageJ для дифференциального подсчета ядер макрофагов и ядер паразитов были доработаны микроскопический анализ счета. Захват изображений с люминесцентным светофильтров и дифференциального интерференционного контраста (DIC) фильтры улучшить качество цифрового изображения для более точного подсчета внутриклеточные паразиты. Оба люминесцентных и DIC изображения могут быть объединены для получения цифровых изображений с четкими контурами макрофагов клетки и внутриклеточные флуоресцентные ядер. Ядрах макрофагов и ядер паразит может быть дифференциально признаны ImageJ. Таким образом, оба Digital-анализа изображений-Директ-Счетчик анализа и паразитов-Rescue-Преобразование-анализа имеют потенциал для автоматизации и применения к крупномасштабной проверки. Важные шаги в паразита-Rescue-преобразования-анализа являются: (а) многократных стирок из THP1 клеточных культур после воздействия Leishmania promastigotes, чтобы обеспечить практически полное удаление не-стажеробобщенные promastigotes и (б) контролируемое лизис инфицированных клеток с THP1 SDS. Обе меры могут также управляться с помощью автоматизации и не должны идти на компромисс с пропускной способностью анализа. Второй этап стирок, после воздействия на Leishmania инфицированных клеток THP1 на тест наркотиков / соединения удаляются оставшиеся без внутреннюю паразитов, если таковые имеются. Паразит-Rescue-Преобразование-анализа дает значительные преимущества по сравнению с существующими микроскопические, ген-репортер и анализы анализа изображений. Анализ простой, надежной и воспроизводимой, может быть автоматизирован для крупномасштабного скрининга и, следовательно, должны иметь важные приложения в скрининг больших библиотек соединений для новых анти-leishmanial лекарственных препаратов. Кроме того, анализ может быть применен и для оценки инфекционной клинической, а также, лабораторных штаммов Leishmania в пробирке.
The authors have nothing to disclose.
NCNPR-USDA-ARS Научно соглашение № 58-6408-2-0009; CDMRP гранта # W81XWH-09-2-0093 американских военно-медицинского исследования и материально-команд.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | コメント |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 |