Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em> ישמניה donovani</em> Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים
概要
טפיל הצלה והמהפך assay עם THP1 תאים הנגועים<em> במבחנה</em> עם<em> ישמניה donovani</em> כבר מותאם לסריקת תרופות אנטי leishmanial. הבדיקה כרוכה בהתמיינות של תאי THP1, זיהום עם promastigotes, טיפול עם תרופות בדיקה, תמוגה מבוקרת של מקרופאגים הנגועים, חילוץ amastigotes, שינוי ולצמיחת promastigotes promastigote ניטור והתרבות עם assay fluorometric.
Abstract
Leishmaniasis הוא אחת המחלות המוזנחות ביותר בעולם, במידה רבה, המשפיע על העניים שבעניים, בעיקר במדינות מתפתחות. מעל 350 מיליון בני אדם נחשבים בסיכון להידבקות leishmaniasis, וכ 2 מיליון מקרים חדשים מתרחשים 1 שנתי. ישמניה donovani הוא הסוכן סיבתי לleishmaniasis הקרבי (VL), הצורה הקטלנית ביותר של המחלה. הבחירה של תרופות זמינות לטיפול בleishmaniasis מוגבלת 2; טיפולים שוטפים לספק יעילות מוגבלת ורבים מהם רעילים במינונים טיפוליים. בנוסף, רוב התרופות לטיפול הקו הראשונות כבר אבד השירות שלהם בשל הגדלת עמידות לתרופות מרובה 3. הצינור הנוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial גם כן מתרוקן בחומרה. מאמצים מתמשכים יש צורך להעשיר את צנרת גילוי חדשה נגד leishmanial סמים, ומאמץ זה מסתמך על הזמינות של דגמים מתאימים בהקרנה חוץ גופייה.
<p cילדה = "jove_content"> בpromastigotes המבחנה 4 מבחני amastigotes axenic 5 משמשים בעיקר לסריקת תרופות אנטי leishmanial עם זאת, ייתכן שאינו מתאים בשל הבדלים משמעותיים סלולריים, פיסיולוגיים, ביוכימי ומולקולרי בהשוואה לamastigotes התאי. מבחנים עם מודלי macrophage-amastigotes נחשבים קרוב ביותר לתנאי pathophysiological של leishmaniasis, ולכן הם המתאימים ביותר להקרנה חוץ גופייה. תאים מובחנים, בלתי מתחלק, אדם חריפים monocytic וקמיה (THP1) (להפוך אטרקטיביים) חלופה למקרופאגים העיקריים המבודדים וניתן להשתמש בו לפעילות אנטי assaying leishmanial של תרכובות שונות נגד amastigotes התאי.כאן, אנו מציגים assay טפיל הצלה והמהפך עם THP1 תאים מובחנים נגועים במבחנה עם ישמניה donovani לסינון תרכובות טהורות ולדרבן טבעייםתמציות ucts וקביעת היעילות נגד amastigotes ישמניה התאית. הבדיקה כוללת את השלבים הבאים: (1) בידול של THP1 תאי המקרופאגים לבלתי מתחלק-, (2) דלקת של מקרופאגים עם ל ' donovani metacyclic promastigotes, (3) טיפול בתאים נגועים בסמי בדיקה, (4) תמוגה מבוקרת של מקרופאגים נגועים, (5) שחרור / הצלת amastigotes ו( 6) טרנספורמציה של amastigotes החי לpromastigotes. Assay היה מותאם באמצעות טיפול חומר ניקוי לתמוגה מבוקרת של תאים THP1 ישמניה נגועים כדי להשיג הצלה כמעט מוחלטת של amastigotes התאי קיימא עם השפעה מינימאלית על היכולת שלהם להפוך לpromastigotes. מקרופאג השונה: יחסי promastigotes נבדקו להשיג זיהום מרבי. כימות הזיהום בוצעו באמצעות הפיכתה של חיה, הציל ישמניה amastigotes לpromastigotes והערכה של הצמיחה שלהם על ידי עלאםassay fluorometric arBlue בmicroplates 96-כן. בדיקה זו היא להשוות בשימוש כיום גן המיקרוסקופי, המהונדס כתב ומבחני ניתוח דיגיטליים של תמונות. בדיקה זו היא איתנה ומודדת את amastigotes תאי החיות בהשוואה לגן הכתב ומבחני ניתוח תמונה, שלא יכול להבדיל בין חיים והמתים amastigotes בלבד. כמו כן, הבדיקה אומתה עם פנל נוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial ויושמה בהצלחה להקרנה בקנה מידה הגדולה של תרכובות טהורות וספרייה של שברי מוצרים טבעיים (Tekwani et al. לא פורסם).
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן מספר שיטות זמינות לסריקת תרופות אנטי leishmanial מבוססת על מודלי macrophage-amastigote. מבחנים ניתן לעשות עם מקרופאגים שנאספו מחיות מארחות תאים כלומר הצפק exudate (PEC), תאי דם היקפיים (monocyte PBMC) 6 או עצם מקרופאגים מח נגזרות (BMM) או בשורות תאי monocytic כגון עכבר (J774 וRAW264.7 ) 7 ואנושיים (THP1, U937, HL-60) 8 תאי monocytic. המבחנים, המשתמשים בחלוקת תאי מארח, חייבים לוודא שהתופעות המבלבלות של פעילות תרופה בטפיל והן מספר תאי מארח נחשבות. המקרופאגים העיקריים הבדיל שנאספו ממקורות שונים כגון עכברים וחולדות שאינם מפרידים-בטבע, אבל הכנות התאים האלה לא יכולות להיות אוכלוסיות תאים הומוגניים. שורות תאי Monocytic תאים שמקורם-הן הומוגני בטבע והנם מודל טוב יותר להקרנה macrophage-amastigote המבוססת. מתוך שורות תאים monocytic שונות, diffeTHP1 תאי rentiated (קו אנושי חריף monocytic וקמיה של תאים) יכולים להיוצר monolayer הלא חלוקה, ומציעים חלופה אטרקטיבית למקרופאגים מבודדים ראשוניים.
הקרנת macrophage-amastigote מבוססת ניתן לעשות זאת בכמה דרכים. הערכה מיקרוסקופית קלסית המבוססת על תא וטפיל ישיר לספור 9 היא עבודה אינטנסיבית. העדר האוטומציה מגביל את התועלת של בדיקה זו. ספירת התאים היא זמן רב ועשויה לתת קביעה מדויקת של 50 ערכי IC מאז קביעת כדאיות טפיל באמצעות הליך הכתמה קשה. צבעי ניאון רבים ונוגדנים חד שבטיים יכולים להיות מועסקים למבחני זרימת cytometric 10, 11, אבל המבחנים האלה הם גם מוגבלים בגלל רגישות והגבלה של פחות מרווח הזמן של תרופה לטיפול ליום אחד בלבד. ישנם מספר מבחני גן הכתב זמין לכימות הצמיחה של amastigotes התאי 12,13,14. אוטומטהקרנת אד עשויה להיות אפשרית באמצעות גנים מדווחים, אבל המבחנים הללו יש גם חסרונות מסוימים. ראשית, רוב המבחנים אלה מחייבים בחירת תרופה לשמירה על ביטוי episomal של הגנים המדווחים, שלא יכול להיות אידיאלי לניסוי הקרנת סמים. הדרך שבה גן הכתב הוא הציג יכול גם להשפיע על התכונות הפיזיולוגיות של הטפיל ולהשפיע על ההקרנה. אם גן הכתב הוא חלק מפלסמיד episomal, התפוקה היחסית של כתב יכולה להיות תלויה במספר העותק של פלסמיד transfected (אשר משתנה מתא לתא) ולא בפעילות של התרופה 14. חלק מטפילי הכתב אשר הפכו טפילים לא צריכים ללחץ ברירה כדי לשמור על גן הכתב, אולם יכול להיות שיש השלכות ביולוגיות או על ידי שיבוש הארכיטקטורה הגנטית או רק על ידי הנוכחות של חלבוני הכתב הזר 15. בחלק ממבחנים מבוססי גן כתב, ישסוגיות של פעילות רגישות ורקע 16. והכי חשובים, רבים ממבחני כתב ביטוי הגנים, במיוחד אחד עם GFP כתב gene15, לא יכולים להבדיל בין amastigotes תאי החיים והמתים. מבחנים מבוססים על גן הכתב לוציפראז יכולים להבחין בין חיים והמתים amastigotes התאי, אבל מצע וחיץ תמוגה תא למבחנים אלה הם יקרים להקרנה בקנה מידה גדולה 17. כדי להתגבר על חסרונות ומגבלות של מבחני מיון קודמים macrophage-amastigote מבוסס אלה, פתחו ואופטימיזציה assay טפיל ההצלה והשינוי הזה. בדיקה זו מבוססת על THP1 תאים, אשר יש הומוגניות טובה והם אינם מפרידים-בטבע, כמו תאי מארח.
Assay הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay המתואר כאן הוא להשוות את assay המבוסס על ספירת תמונה דיגיטלית-ניתוח ישיר של amastigotes התאי. מיקרוסקופיה פלורסנט ודסק"ש, דיגיטלי ולדמייןניתוחי דואר על ידי ImageJ לספירת הפרש של גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל שפרו את assay הספירה המיקרוסקופית נוספים. לכידת התמונות תחת מסנני אור ניאון וניגודיות פער התערבות (DIC) מסננים שפרה את איכות התמונה הדיגיטלית לספירה מדויקת יותר של טפילים תוך תאיים. תמונות שניהם ניאון ודסק"ש ניתן התמזגה כדי להשיג את התמונות הדיגיטליות בקווי מתאר ברורים macrophage סלולריים וגרעינים תאיים ניאון. גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל יכולים להיות מוכרים באופן דיפרנציאלי עם ImageJ. לכן, שניהם—ספירה-Assay תמונה דיגיטלי-ניתוח ישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay יש פוטנציאל לאוטומציה ויישום להקרנה בקנה מידה גדולה. השלבים הקריטיים בטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay הם: (א) כביסות חוזרות ונשנות של THP1 תרביות תאים לאחר חשיפה לpromastigotes ישמניה, כדי להבטיח הסרה מוחלטת כמעט שאינם מתמחהpromastigotes alized ו( ב) תמוגה מבוקרת של התאים הנגועים THP1 עם SDS. שני הצעדים עלולים גם להיות נשלטו עם אוטומציה ולא צריך להתפשר עם תפוקה של assay. השלב השני של כביסות, לאחר חשיפה של ישמניה THP1 התאים הנגועים לבדיקת הסמים / התרכובות מסיר את הטפילים הנותרים אינם מופנמים, אם בכלל. הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay מציע יתרונות משמעותיים על פני, גן קיים מיקרוסקופי כתב ומבחני ניתוח תמונה. הבדיקה היא פשוטה, חזקה, ושחזור, יכולה להיות אוטומטית להקרנה בקנה מידה גדולה, ולכן צריך להיות יישום חשוב בהקרנה של ספריות תרכובות גדולות לגילוי סמים אנטי leishmanial חדש. יתר על כן, הבדיקה יכולה להיות מיושמת גם להערכת infectivity של קליני, כמו גם, שבודדה במעבדה של ישמניה במבחנה.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הסכם NCNPR-USDA-ARS המדעי המספר 58-6408-2-0009; פרס CDMRP מענק # W81XWH-09-2-0093 על ידי הצבא האמריקאי למחקר רפואי ואמצעי פיקוד.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalog Number | コメント |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
参考文献
- WHO. . Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug Resistance in Leishmaniasis. Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
