Un test parasite de sauvetage et de la transformation des cellules infectées THP1<em> In vitro</em> Avec<em> Leishmania donovani</em> A été optimisé pour le criblage de médicaments anti-leishmania. L'essai implique la différenciation des cellules THP1, l'infection par promastigotes, le traitement par médicaments à l'essai, la lyse contrôlée des macrophages infectés, le sauvetage des amastigotes, la transformation et la croissance des promastigotes de promastigotes de surveillance et la prolifération d'un dosage fluorimétrique.
La leishmaniose est l'une des maladies les plus négligées dans le monde, en grande partie touchant les plus pauvres d'entre les pauvres, surtout dans les pays en développement. Plus de 350 millions de personnes sont considérées à risque de contracter la leishmaniose, et environ 2 millions de nouveaux cas se produisent chaque année 1. Leishmania donovani est l'agent causal de la leishmaniose viscérale (LV), la forme la plus mortelle de la maladie. Le choix des médicaments disponibles pour traiter la leishmaniose est limitée 2; traitements actuels fournissent une efficacité limitée et beaucoup sont toxiques à des doses thérapeutiques. En outre, la plupart des médicaments de première ligne de traitement ont déjà perdu leur utilité en raison de la résistance croissante de drogues multiples 3. Le portefeuille actuel de médicaments anti-leishmania est aussi gravement appauvri. Des efforts soutenus sont nécessaires pour enrichir un nouvel anti-leishmaniose pipeline de découverte de médicaments, et cet effort repose sur la disponibilité des modèles adaptés au dépistage in vitro.
<p class = "jove_content"> En promastigotes in vitro 4 et axéniques essais amastigotes 5 sont principalement utilisés pour le criblage de médicaments anti-leishmaniose peut toutefois ne pas être approprié en raison d'importantes différences physiologiques cellulaires, biochimiques et moléculaires par rapport à amastigotes intracellulaires. Essais avec des macrophages-amastigotes modèles sont considérés comme les plus proches des conditions physiopathologiques de la leishmaniose, et sont donc le plus approprié pour le criblage in vitro. Différenciées ne se divisant aiguës chez l'homme des cellules THP1 (leucémie monocytaire) (crée un attractif) alternative à macrophages primaires isolées et peuvent être utilisées pour doser l'activité anti-leishmanienne de différents composés contre amastigotes intracellulaires.Ici, nous présentons une analyse parasite de sauvetage et de transformation avec THP1 différenciées des cellules infectées in vitro avec Leishmania donovani pour le criblage de composés purs et produits naturelsduits extraits et détermination de l'efficacité contre les amastigotes intracellulaires. Le dosage comprend les étapes suivantes: (1) la différenciation de cellules THP1 à la non-séparation des macrophages, (2) l'infection des macrophages par L. donovani promastigotes métacycliques, (3) le traitement des cellules infectées avec des médicaments d'essai, (4) la lyse contrôlée de macrophages infectés, (5) la libération / sauvetage d'amastigotes et (6) la transformation d'amastigotes vivants vers promastigotes. Le test a été optimisée à l'aide de détergent pour le traitement de lyse contrôlée infectés par Leishmania cellules THP1 pour atteindre presque totale de sauvetage amastigotes intracellulaires viables avec un effet minimal sur leur capacité à se transformer en promastigotes. Macrophages différente: les ratios de promastigotes ont été testés pour infecter maximum. La quantification de l'infection a été réalisée grâce à la transformation de vivre, sauvé Leishmania promastigotes amastigotes de l'évaluation et de leur croissance par un alamarBlue essai fluorimétrique en microplaques de 96 puits. Ce test est comparable à l'heure actuelle, utiliser microscopique, gène rapporteur transgénique et l'image numérique-tests d'analyse. Ce test est robuste et ne mesure que les amastigotes intracellulaires vivants par rapport à gène rapporteur et tests d'analyse d'images, qui ne peut différencier les amastigotes vivants et morts. En outre, le test a été validé avec un panneau courant de l'anti-leishmania médicaments et a été appliquée avec succès à grande échelle criblage de composés purs et une bibliothèque de fractions de produits naturels (Tekwani et al. Non publié).
Il existe plusieurs méthodes disponibles pour le criblage de médicaments anti-leishmaniose basée sur des macrophages amastigotes modèles. Les dosages peut être fait avec les macrophages prélevés chez des animaux hôtes cellules d'exsudat péritonéal savoir (PEC), les cellules monocytes du sang périphérique (PBMC) 6 ou d'os dérivées de la moelle macrophages (BMM) ou dans des lignées cellulaires monocytaires comme la souris (J774 et RAW264.7 ) 7 et humaines (THP1, U937, HL-60) 8 cellules monocytaires. Les analyses, qui utilisent les cellules en division d'accueil, doit s'assurer que les effets confondants de l'activité du médicament à la fois sur les parasites et les cellules hôtes sont considérés comme nombre. Les macrophages différenciés primaires recueillies auprès de diverses sources comme les souris et les rats sont non-division dans la nature, mais ces préparations cellulaires peuvent ne pas être des populations cellulaires homogènes. Lignées de cellules monocytaires cellules dérivées sont-homogène dans la nature et sont un meilleur modèle pour le dépistage des macrophages amastigote basée. Sur les différentes lignées de cellules monocytaires, différentiated cellules THP1 (aiguë humaine ligne cellulaire de leucémie monocytaire) peuvent former une monocouche non de division et d'offrir une alternative intéressante aux primaires des macrophages isolés.
Le dépistage des macrophages amastigotes base peut être fait de plusieurs façons. Classique évaluation microscopique basé sur la cellule directe et parasite de comptage 9 est un travail intensif. L'absence d'automatisation limite l'utilité de cet essai. Le comptage des cellules prend du temps et peut donner de détermination inexacte des valeurs de CI50 puisque la détermination de la viabilité du parasite à travers une procédure de coloration est difficile. Beaucoup de colorants fluorescents et les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour des essais de cytométrie en flux 10, 11, mais ces tests sont également limitées en raison de moins de sensibilité et de limitation de l'intervalle de temps de traitement de la toxicomanie à une seule journée. Il existe plusieurs tests de gènes rapporteurs disponibles pour quantifier la croissance des amastigotes intracellulaires 12,13,14. Un automateed dépistage peut être possible en utilisant des gènes rapporteurs, mais ces essais ont aussi certains inconvénients. Tout d'abord, la majorité de ces tests nécessitent la sélection des médicaments pour le maintien de l'expression épisomique des gènes rapporteurs, qui ne peut être idéal pour une expérience de dépistage de drogue. La manière par laquelle le gène rapporteur est introduit peut également influer sur les propriétés physiologiques du parasite et avoir un impact sur le dépistage. Si le gène rapporteur est la partie d'un plasmide épisomique, la sortie relative de rapporteur peut dépendre du nombre de copies du plasmide transfecté (qui varie de cellule en cellule), plutôt que sur l'activité de la drogue 14. Certains parasites journaliste qui se transforment parasites n'avez pas besoin de maintenir la pression sélective du gène rapporteur, mais il pourrait y avoir des conséquences biologiques soit en perturbant l'architecture génomique ou tout simplement par la présence des protéines reporters étrangers 15. Dans certains dosages de gènes rapporteurs base, il yales questions de sensibilité et l'activité de fond 16. Plus important encore, un grand nombre de dosages de rapporteur de l'expression génique, spécialement celui avec la GFP journaliste gene15, ne peut pas différencier entre les amastigotes intracellulaires vivants et morts. Tests basés sur le gène rapporteur de la luciférase peut discerner entre vivants et morts amastigotes intracellulaires, mais substrat et un tampon de lyse cellulaire pour ces tests sont coûteux pour dépistage à grande échelle 17. Pour remédier à ces inconvénients et limitations des tests de criblage précédentes macrophages amastigotes base, nous avons développé et optimisé ce test parasite de sauvetage et de transformation. Ce test est basé sur des cellules THP1, qui ont une bonne homogénéité et ne sont pas de division dans la nature, comme cellules hôtes.
Le test Parasite-sauvetage-Transformation-test décrit ici est comparable à l'analyse fondée sur Digital-image-Analyse-Direct-comptage des amastigotes intracellulaires. Microscopie à fluorescence et DIC, imagerie numériqueanalyses par e ImageJ pour comptage différentiel des noyaux macrophages et les noyaux du parasite ont affiné l'analyse comptage microscopique. Capturer les images sous filtres fluorescents et le contraste d'interférence différentiel (DIC) filtres ont amélioré la qualité de l'image numérique pour le comptage plus précis des parasites intracellulaires. Images fluorescentes et DIC peuvent être fusionnées afin d'obtenir des images numériques avec des contours clairs de cellules macrophages et les noyaux fluorescent intracellulaire. Les noyaux des macrophages et des noyaux parasite peut être différemment reconnu avec ImageJ. Par conséquent, à la fois numérique-image-Analyse-Direct-comptage-test et Parasite-sauvetage-Transformation-test ont le potentiel pour l'automatisation et l'application à grande échelle de dépistage. Les étapes essentielles de l'Parasite-sauvetage-Transformation-test sont les suivants: (a) des lavages répétés des cultures de cellules THP1 après exposition à promastigotes de Leishmania, pour assurer une élimination presque complète de la non-stagiairelisés promastigotes et (b) de lyse contrôlée des cellules infectées avec THP1 SDS. Les deux étapes peuvent également être contrôlée grâce à l'automatisation et ne doit pas compromettre avec un débit de l'essai. La deuxième étape de lavage, après exposition des cellules THP1 infectées de Leishmania aux médicaments d'essai / supprime les autres composés non internalisés parasites, le cas échéant. Le Parasite-sauvetage-Transformation-test offre des avantages significatifs sur existants gène rapporteur microscopique et des tests d'analyse d'images. Le test est simple, robuste et reproductible, peut être automatisé à grande échelle de dépistage et devrait donc avoir des applications importantes dans le criblage de banques de composés grands pour la découverte de nouveaux médicaments anti-leishmania. En outre, le dosage peut également être appliqué pour l'évaluation de l'infectiosité de clinique, ainsi que, isolats de laboratoire de Leishmania in vitro.
The authors have nothing to disclose.
L'accord NCNPR-USDA-ARS scientifique n ° 58-6408-2-0009; CDMRP subvention Award # W81XWH-09-2-0093 par l'US Army Medical Research et le Commandement du matériel.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | コメント |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 |