Summary

Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Published: February 09, 2024
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Summary

Un metodo per l’isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.

Abstract

Le cellule staminali neurali tessuto-specifiche (NSC) rimangono attive nel cervello postnatale dei mammiferi. Risiedono in nicchie specializzate, dove generano nuovi neuroni e glia. Una di queste nicchie è la zona subependimale (SEZ; chiamata anche zona ventricolare-subventricolare), che si trova lungo le pareti laterali dei ventricoli laterali, adiacente allo strato cellulare ependimale. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono abbondantemente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, costituendo un pool di cellule progenitrici proliferative che possono generare oligodendrociti.

Sia le NSC che le OPC mostrano un potenziale di auto-rinnovamento e cicli di quiescenza/attivazione. A causa della loro posizione, l’isolamento e l’indagine sperimentale di queste cellule viene eseguita post mortem. Qui descriviamo in dettaglio la “mungitura cerebrale”, un metodo per l’isolamento di NSC e OPC, tra le altre cellule, da animali vivi. Si tratta di un protocollo in due fasi progettato per l’uso nei roditori e testato nei ratti. In primo luogo, le cellule vengono “rilasciate” dal tessuto tramite iniezione intracerebroventricolare stereotassica (i.c.v.) di un “cocktail di rilascio”. I componenti principali sono la neuraminidasi, che prende di mira le cellule ependimali e induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l’integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti-2. In una seconda fase di “raccolta” vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale dalla cisterna magna, in ratti anestetizzati senza necessità di incisione.

I risultati qui presentati mostrano che le cellule isolate mantengono il loro profilo endogeno e che le NSC della ZES conservano la loro quiescenza. La denudazione dello strato ependimale è limitata al livello anatomico dell’iniezione e il protocollo (rilascio e raccolta) è ben tollerato dagli animali. Questo nuovo approccio apre la strada all’esecuzione di studi longitudinali sulla neurogenesi endogena e sulla gliogenesi negli animali da esperimento.

Introduction

Le cellule staminali tessuto-specifiche sono cellule parzialmente impegnate che possono dare origine a tutte le popolazioni cellulari che costituiscono i rispettivi tessuti. Oltre ad essere multipotenti, sono cellule che si autorinnovano e sono fondamentali per mantenere l’omeostasi e la capacità rigenerativa dei tessuti1. Alcune cellule staminali tessuto-specifiche rimangono in uno stato attivo e fortemente proliferativo, come le cellule staminali intestinali o ematopoietiche. Altri, come le cellule staminali cerebrali, rimangono in gran parte quiescenti o dormienti2. Nel cervello adulto, le cellule staminali neurali (NSC) possono essere trovate in aree specializzate, spesso chiamate nicchie. Due di queste aree ben descritte esistono nella zona subependimale (SEZ) dei ventricoli laterali e nel giro dentato dell’ippocampo. La nicchia SEZ genera il maggior numero di cellule, principalmente neuroblasti che migrano verso i bulbi olfattivi e contribuiscono alla popolazione interneuronale locale; al contrario, gli oligodendroblasti generati migrano verso l’adiacente corpo calloso (CC)3. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono cellule mitoticamente attive, ampiamente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, che: i) sono impegnate nella linea oligodendrogliale, ii) possono migrare verso i siti di demielinizzazione e iii) possono differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti. Gli OPC mostrano anche un potenziale di auto-rinnovamento e di quiescenza4.

Fino ad ora, l’isolamento e lo studio di NSC e OPC richiedevano la dissociazione post mortem del cervello sezionato e del tessuto del midollo spinale. Per aggirare questa limitazione sperimentale, abbiamo stabilito un metodo che consente, per la prima volta, l’isolamento di NSC e OPC cerebrali da animali vivi. Chiamiamo questo metodo “mungitura”, perché consente più raccolte di cellule poiché i loro pool non sono esauriti. Il protocollo è stato sviluppato nei ratti, a causa delle loro grandi dimensioni cerebrali, prendendo di mira principalmente la ZES, o CC, e comprende due passaggi principali. In primo luogo, le NSC o OPC vengono “rimosse” dal tessuto tramite iniezione endovenosa di un “cocktail di rilascio” contenente neuraminidasi, una tossina che induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l’integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2). Il cocktail viene iniettato stereotassicamente bilateralmente all’interno dei ventricoli laterali. Se l’uso previsto è l’isolamento delle NSC, vengono prese di mira le aree rostrali dei ventricoli laterali. Se l’obiettivo è quello di isolare gli OPC in modo più puro, il cocktail viene iniettato caudalmente nell’area della fimbria dell’ippocampo. In una seconda fase di “raccolta”, vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale (CSF) dalla cisterna magna di ratti anestetizzati senza la necessità di un’incisione. La biopsia liquida viene miscelata con il terreno di coltura NSC e può essere mantenuta a 4 °C fino alla placcatura.

Protocol

L’allevamento, il mantenimento e le procedure sperimentali degli animali sono stati condotti in conformità con l’UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizzato dal Ministero dell’Interno, e con il Decreto Presidenziale 56/2013 della Repubblica Ellenica, esaminati dagli Organi di Revisione Etica e per il Benessere degli Animali delle Università di Cambridge e Patrasso, nonché approvati e controllati dal Comitato locale per la cura e l’uso degli animali della Prefettura (Numero di protocollo: 5675/39/18-01-20…

Representative Results

Rilascio e raccolta di NSCLe NSC della ZES sono separate dal liquido cerebrospinale solo dal monostrato di cellule ependimali, sebbene rimangano in contatto diretto con il contenuto ventricolare attraverso processi monociliati intercalanti 8,9. La neuraminidasi agisce in modo specifico sulle cellule ependimali attraverso la scissione dei residui di acido sialico e può indurre la denudazione della parete ventricolare. Questo…

Discussion

Le cellule staminali e progenitrici sono relativamente scarse nel tessuto cerebrale dei mammiferi. Inoltre, le NSC sono localizzate in aree inaccessibili per biopsie facili e sicure (pareti ventricolari, ippocampo). Pertanto, l’unico modo per lavorare sperimentalmente con tali cellule, finora, è stato il loro isolamento post mortem. Un metodo che consente la raccolta singola o ripetuta di NSC e OPC da ratti vivi, chiamato mungitura, è descritto qui passo dopo passo. Il metodo si basa su due caratteristiche chiave: i) l…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di Action Medical Research (UK) (GN2291) a R.J.M.F. e I.K. Il lavoro di ricerca è stato anche in parte sostenuto (costi animali e sostegno a D.D) dalla Fondazione ellenica per la ricerca e l’innovazione (H.F.R.I.) nell’ambito del “Primo bando per progetti di ricerca H.F.R.I. a sostegno dei membri della facoltà e dei ricercatori e l’approvvigionamento di sovvenzioni per attrezzature di ricerca ad alto costo” (numero di progetto: 3395).

Materials

Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody BD Biosciences #555002 purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) Sigma-Aldrich #N2876 Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech #100-18B kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe Hamilton #80330 Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes BD biosciences 04085-00 29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML LAVIPHARM-CASTALIA SKU: 5201048131168
Bupaq RICHTERPHARMA 1021854AF 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse Stoelting 51500D
Homeothermic Monitoring System Harvard Apparatus 55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid Vetpharma Animal Health 32509/4031
Ketamidor RICHTER PHARMA SKU: 9004114002531 Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon Ethicon D9635 Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers Stoelting Item:51472
Scalpel blades, sterile Swann Morton AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs Birchwood Laboratories 34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill Foredom 1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit Stoelting Item: 52189
Xylan 2% Chanelle Pharmaceuticals 13764/03/19-5-2004 Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy Greiner #655866 Screen star microplate
B27 supplement ThermoFisher Scientific A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck P06-1391100 Fraction V, heat shock
Citrate Merck 71497 Sodium citrate monobasic
Cryostat Leica CM1510S
DAPI Merck, Calbiochem 28718-90-3 Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM ThermoFisher Scientific 11995065 High glucose, pyruvate
donkey anti-goat Biotium 20016 or 20106 or 20048 Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse Biotium 20014 or 20105 or 20046 Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit Biotium 20015 or 20098 or 20047 Dilution: 1/1,000
EGF Peprotech 315-09
FGF-2 (or bFGF) Peprotech 100-18B
goat anti-GFAP Abcam ab53554 Dilution: 1/500
goat anti-SOX2 Santa Cruz Biotecnology sc-17320 Dilution: 1/200
mouse anti-ID3 Santa Cruz Biotecnology sc-56712 Dilution: 1/200
mouse anti-S100β Sigma S2532 Dilution: 1/200
Mowiol Merck, Calbiochem 475904 Mounting medium
N2 supplement ThermoFisher Scientific 17502048
Parafolmadehyde Merck 158127
Poly-D-Lysine Merck, Millipore A-003-E Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX) Abcam ab18723 Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα Abcam ab51875 Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin Abcam ab16051 Dilution: 1/500
Triton X-100 Merck X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope Leica SP6 and SP8
Image analysis NIH, USA ImageJ
Image analysis Leica LasX

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Dimitrakopoulos, D., Dimitriou, C., McClenahan, F., Franklin, R. J. M., Kazanis, I. The “Brain Milking” Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats. J. Vis. Exp. (204), e65308, doi:10.3791/65308 (2024).

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