La méthode de « traite cérébrale » pour l’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes provenant de rats vivants
Summary
Une méthode d’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes à partir du cerveau de rats vivants est présentée ici en détail expérimental. Il permet de multiples prélèvements de ces cellules chez les mêmes animaux sans compromettre leur bien-être.
Abstract
Les cellules souches neurales (CSN) spécifiques aux tissus restent actives dans le cerveau postnatal des mammifères. Ils résident dans des niches spécialisées, où ils génèrent de nouveaux neurones et des cellules gliales. L’une de ces niches est la zone sous-épendymaire (ZES, également appelée zone ventriculaire-sous-ventriculaire), qui est située à travers les parois latérales des ventricules latéraux, adjacentes à la couche de cellules épendymaires. Les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) sont abondamment réparties dans tout le système nerveux central, constituant un pool de cellules progénitrices prolifératives capables de générer des oligodendrocytes.
Les NSC et les OPC présentent tous deux un potentiel d’auto-renouvellement et des cycles de quiescence/activation. En raison de leur emplacement, l’isolement et l’investigation expérimentale de ces cellules sont effectués post-mortem. Nous décrivons ici en détail la « traite cérébrale », une méthode d’isolement des NSC et des OPCs, entre autres cellules, à partir d’animaux vivants. Il s’agit d’un protocole en deux étapes conçu pour être utilisé chez les rongeurs et testé chez les rats. Tout d’abord, les cellules sont « libérées » du tissu par injection intra-intra-ventriculaire stéréotaxique (i.c.v.) d’un « cocktail de libération ». Les principaux composants sont la neuraminidase, qui cible les cellules épendymaires et induit la dénudation de la paroi ventriculaire, un anticorps bloquant l’intégrine-β1, et le facteur de croissance des fibroblastes-2. Lors d’une deuxième étape de « prélèvement », des biopsies liquides du liquide céphalorachidien sont réalisées à partir de la citerne magna, chez des rats anesthésiés sans avoir besoin d’une incision.
Les résultats présentés ici montrent que les cellules isolées conservent leur profil endogène et que les CSN de la ZES préservent leur quiescence. La dénudation de la couche épendymaire est limitée au niveau anatomique de l’injection et le protocole (libération et prélèvement) est bien toléré par les animaux. Cette nouvelle approche ouvre la voie à la réalisation d’études longitudinales de la neurogenèse endogène et de la gliogenèse chez les animaux de laboratoire.
Introduction
Les cellules souches tissulaires spécifiques sont des cellules partiellement engagées qui peuvent donner naissance à toutes les populations cellulaires qui constituent les tissus respectifs. En plus d’être multipotentes, ce sont des cellules auto-renouvelables et cruciales pour le maintien de l’homéostasie et de la capacité de régénération des tissus1. Certaines cellules souches tissulaires restent actives et fortement prolifératives, comme les cellules souches intestinales ou hématopoïétiques. D’autres, comme les cellules souches cérébrales, restent en grande partie au repos ou dormantes2. Dans le cerveau adulte, les cellules souches neurales (CSN) peuvent être trouvées dans des zones spécialisées, souvent appelées niches. Deux de ces zones bien décrites existent dans la zone sous-épendymaire (ZES) des ventricules latéraux et dans le gyrus denté de l’hippocampe. La niche des ZES génère le plus grand nombre de cellules, principalement des neuroblastes qui migrent vers les bulbes olfactifs et contribuent à la population locale d’interneurones ; en revanche, les oligodendroblastes générés migrent vers le corps calleux (CC)3 adjacent. Les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) sont des cellules mitotiquement actives, largement distribuées dans tout le système nerveux central, qui : i) sont engagées dans la lignée oligodendrogliale, ii) peuvent migrer vers des sites de démyélinisation et iii) peuvent se différencier en oligodendrocytes myélinisants. Les OPC présentent également un potentiel d’auto-renouvellement et de quiescence4.
Jusqu’à présent, l’isolement et l’étude des NSC et des OPC nécessitaient une dissociation post-mortem des tissus cérébraux et moelle épinière disséqués. Pour contourner cette limitation expérimentale, nous avons mis au point une méthode qui permet, pour la première fois, d’isoler les NSC et OPC cérébraux d’animaux vivants. Nous appelons cette méthode « traite », car elle permet de collecter plusieurs cellules car leurs réserves ne sont pas épuisées. Le protocole a été développé chez le rat, en raison de la grande taille de son cerveau, ciblant principalement la ZES, ou CC, et comprend deux étapes principales. Tout d’abord, les NSC ou OPC sont « éliminés » du tissu par injection intraveineuse d’un « cocktail de libération » contenant de la neuraminidase, une toxine qui induit la dénudation de la paroi ventriculaire, un anticorps bloquant l’intégrine-β1 et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2). Le cocktail est injecté par stéréotaxie bilatéralement dans les ventricules latéraux. Si l’utilisation prévue est l’isolement des NSC, les zones rostrales des ventricules latéraux sont ciblées. Si l’objectif est d’isoler plus purement les OPC, le cocktail est injecté par voie caudale dans la zone des fimbria de l’hippocampe. Lors d’une deuxième étape de « prélèvement », des biopsies liquides de liquide céphalorachidien (LCR) sont effectuées à partir de la citerne magna de rats anesthésiés, sans qu’il soit nécessaire d’incision. La biopsie liquide est mélangée avec un milieu de culture NSC et peut être conservée à 4 °C jusqu’au dressage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules souches et progénitrices sont relativement rares dans les tissus cérébraux des mammifères. De plus, les CSN sont situés dans des zones inaccessibles pour des biopsies faciles et sûres (parois ventriculaires, hippocampe). Par conséquent, la seule façon de travailler expérimentalement avec de telles cellules, jusqu’à présent, a été leur isolement post-mortem. Une méthode permettant la collecte unique ou répétée de NSC et d’OPC sur des rats vivants, appelée traite, est décrite ici étape …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention d’Action Medical Research (UK) (GN2291) à R.J.M.F. et I.K. Les travaux de recherche ont également été partiellement financés (coûts des animaux et soutien à D.D.) par la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (H.F.R.I.) dans le cadre du « Premier appel à projets de recherche H.F.R.I. pour soutenir les membres du corps professoral et les chercheurs et l’obtention d’une subvention d’équipement de recherche à coût élevé » (numéro de projet : 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Riferimenti
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