Aquí presentamos el principio, la estructura y las instrucciones del sistema inteligente de detección de fagos / pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento. Su aplicación se ilustra utilizando como ejemplo la Salmonella aislada de aves de corral en Shandong, China. Se calcula el índice Lar y se discute exhaustivamente su importancia en la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos.
Para mejorar la eficiencia de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) y el cribado de alto rendimiento de fagos para bacterias resistentes y para reducir el coste de detección, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos, un convertidor de adquisición de imágenes y el software correspondiente, de acuerdo con los criterios AST y los puntos de ruptura de resistencia (R) formulados por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). La AST y las estadísticas de las distribuciones de la concentración inhibitoria mínima (CMI) (de R/8 a 8R) de 1.500 cepas de Salmonella aisladas de aves de corral en Shandong, China, frente a 10 agentes antimicrobianos se llevaron a cabo mediante el sistema inteligente de cribado de ast/fagos de alto rendimiento. El índice Lar, que significa “menos antibiosis, menos resistencia y residual hasta poca antibiosis”, se obtuvo calculando la media ponderada de cada CMI y dividiéndola por R. Este enfoque mejora la precisión en comparación con el uso de la prevalencia de resistencia para caracterizar el grado de resistencia a los antimicrobianos (RAM) de cepas altamente resistentes. Para las cepas de Salmonella con alta resistencia a los antimicrobianos, los fagos líticos se seleccionaron eficientemente de la biblioteca de fagos mediante este sistema, y se calculó y analizó el espectro de lisis. Los resultados mostraron que el sistema inteligente de cribado de fagos y AST de alto rendimiento era operable, preciso, altamente eficiente, económico y fácil de mantener. En combinación con el sistema de monitoreo de la resistencia a los antimicrobianos veterinarios de Shandong, el sistema era adecuado para la investigación científica y la detección clínica relacionada con la resistencia a los antimicrobianos.
Dado que los agentes antimicrobianos se han utilizado ampliamente para prevenir enfermedades infecciosas bacterianas, la resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha convertido en un problema de salud pública mundial1. La lucha contra la resistencia a los antimicrobianos es la misión principal actual de seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos de patógenos epidemiológicos y la terapia sinérgica de agentes antimicrobianos sensibles y bacteriófagos líticos2.
Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) in vitro son el pilar para monitorizar el tratamiento y detectar el nivel de RAM. Es una parte importante de la farmacología antimicrobiana y la base crítica de la medicación clínica. El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) de los Estados Unidos y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) han formulado y revisado los criterios internacionales de AST y han modificado y complementado continuamente los métodos AST y los puntos de corte para determinar la CMI de una determinada combinación de “organismo-agente antimicrobiano” como sensible (S), resistente (R) o intermedio (I)3, 4.
Desde la década de 1980 hasta la década de 1990, los instrumentos automáticos de dilución de microcaldo se desarrollaron rápidamente y se aplicaron a la práctica clínica, con ejemplos como Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM y Cobasbact 5,6,7. Sin embargo, estos instrumentos eran costosos, requerían consumibles de alto costo y sus rangos de detección fueron diseñados para la medicación clínicade pacientes 5,6,7. Por estas razones, no son adecuados para el examen clínico veterinario y la detección de grandes cantidades de cepas altamente resistentes. En este estudio, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos (Figura 1), un convertidor de adquisición de imágenes (Figura 2) y el software correspondiente8, para realizar AST para un lote de cepas de bacterias contra múltiples agentes antimicrobianos a la vez mediante el método de dilución en agar. Además, el sistema también se utilizó para detectar y analizar los patrones de lisis de los fagos frente a bacterias resistentes a los antimicrobianos9, y los fagos líticos se seleccionaron de forma eficiente de la biblioteca de fagos. Se comprobó que este sistema era eficiente, asequible y fácil de operar.
Figura 1: Diagrama estructural del inoculador de matriz de 96 puntos. 1: Placa de clavija de inoculación; 2: Operador de telefonía móvil; 3: Bloque de semillas; 4: Placa incubada; 5: Base; 6: Mango de operación; 7: Pin de límite. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama estructural del convertidor de adquisición de imágenes. 1: Concha; 2: Pantalla de visualización; 3: Sala de adquisición de imágenes; 4: Base de la placa de detección; 5: Tablero de detección dentro y fuera del almacén; 6: Tablero de control; 7: Dispositivo de conversión de adquisición de imágenes; 8: Fuente de luz; 9: Escáner de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El método de dilución en agar está bien establecido y se utiliza ampliamente. El principio del sistema AST de alto rendimiento era el del método de dilución en agar. Uno de los pasos críticos dentro del protocolo fue la transferencia precisa de alto rendimiento de 96 inóculos a la vez, que se realizó varias veces seguidas. Para completar este paso crítico, los pines del inoculador de matriz de 96 puntos eran uniformes y muy suaves. La deposición natural de cada pin fue de un volumen de aproximadamente 2 μL, qu…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2019YFA0904003); Sistema Agrícola Industrial Moderno en la Provincia de Shandong (SDAIT-011-09); Proyecto de Optimización de la Plataforma de Cooperación Internacional (CXGC2023G15); Principales tareas de innovación del proyecto de innovación científica y tecnológica agrícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China (CXGC2023G03).
96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |