Summary

Применение интеллектуальной высокопроизводительной системы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам/скрининга фагов и индекса устойчивости к противомикробным препаратам Lar

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Здесь мы познакомим вас с принципом, структурой и инструкцией интеллектуальной высокопроизводительной системы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам/скрининга фагов. Его применение проиллюстрировано на примере сальмонеллы , выделенной от домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай. Рассчитан индекс Лара и всесторонне рассмотрено его значение в оценке антимикробной резистентности.

Abstract

Для повышения эффективности тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) и высокопроизводительного скрининга фагов на резистентные бактерии, а также для снижения затрат на обнаружение, была разработана интеллектуальная высокопроизводительная система AST/фагового скрининга, включающая 96-точечный матричный инокулятор, преобразователь получения изображений и соответствующее программное обеспечение, в соответствии с критериями AST и точками разрыва резистентности (R), сформулированными Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). АСТ и статистические данные о распределении минимальной ингибирующей концентрации (МПК) (от R/8 до 8R) 1500 штаммов сальмонеллы , выделенных от домашней птицы в Шаньдуне, Китай, по сравнению с 10 антимикробными агентами были проведены с помощью интеллектуальной высокопроизводительной системы скрининга АСТ/фагов. Индекс Лара, означающий «меньше антибиотика, меньше резистентности и остаточный до тех пор, пока антибиотика мало», был получен путем вычисления средневзвешенного значения каждого МПК и деления на R. Такой подход повышает точность по сравнению с использованием показателя распространенности резистентности для характеристики степени устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) штаммов с высокой устойчивостью. Для штаммов сальмонелл с высоким УПП литические фаги были эффективно отобраны из библиотеки фагов с помощью этой системы, а также рассчитан и проанализирован спектр лизиса. Результаты показали, что интеллектуальная высокопроизводительная система скрининга АСТ/фагов является работоспособной, точной, высокоэффективной, недорогой и простой в обслуживании. В сочетании с Шаньдунской ветеринарной системой мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам эта система была пригодна для научных исследований и клинического выявления УПП.

Introduction

Поскольку противомикробные препараты широко используются для профилактики бактериальных инфекционных заболеваний, устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) стала глобальной проблемой общественногоздравоохранения1. Борьба с УПП в настоящее время является основной миссией мониторинга УПП эпидемиологических патогенов и синергической терапии чувствительных антимикробных препаратов и литических бактериофагов2.

Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам in vitro (АСТ) является основой для мониторинга терапии и определения уровня УПП. Это важная часть фармакологии противомикробных препаратов и важнейшая основа для клинических препаратов. Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI) Соединенных Штатов Америки и Европейский комитет по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам (EUCAST) сформулировали и пересмотрели международные критерии АСТ, а также постоянно модифицировали и дополняли методы АСТ и контрольные точки для определения МПК одной определенной комбинации «организм-антимикробный агент» как чувствительного (S), резистентного (R) или промежуточного (I)3. 4. См.

В период с 1980-х по 1990-е годы были быстро разработаны и применены в клинической практике автоматические приборы для разведения микробульона, в том числе Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM и Cobasbact 5,6,7. Однако эти приборы были дорогими, требовали дорогостоящих расходных материалов, а их диапазоны обнаружения были рассчитаны на клиническое лечение пациентов 5,6,7. По этим причинам они не подходят для ветеринарного клинического обследования и выявления больших количеств высокорезистентных штаммов. В данном исследовании была разработана интеллектуальная высокопроизводительная система скрининга АСТ/фагов, включающая 96-точечный матричный инокулятор (рис. 1), преобразователь получения изображений (рис. 2) и соответствующее программное обеспечение8, для проведения АСТ для партии штаммов бактерий против нескольких антимикробных агентов одновременно методом агарового разведения. Кроме того, система также использовалась для обнаружения и анализа паттернов лизиса фагов против устойчивых к противомикробным препаратам бактерий9, а литические фаги были эффективно отобраны из библиотеки фагов. Эта система оказалась эффективной, доступной и простой в эксплуатации.

Figure 1
Рисунок 1: Структурная схема 96-точечного матричного инокулятора. 1: Штифтовая пластина для прививки; 2: Оператор мобильной связи; 3: Исходный блок; 4: Инкубационная пластина; 5: База; 6: Рукоятка управления; 7: Ограничительный штифт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Структурная схема конвертера для получения изображений. 1: Оболочка; 2: Экран дисплея; 3: Помещение для получения изображений; 4: Основание платы детектирования; 5: Доска обнаружения на складе и за его пределами; 6: Пульт управления; 7: Устройство преобразования изображения; 8: Источник света; 9: Сканер изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Штаммы сальмонеллы, использованные в этом исследовании, были получены от домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай, после получения одобрения от Комитета по биобезопасности Института животноводства и ветеринарной медицины Шаньдунской академии сельскохозяйственных наук, Китай.</…

Representative Results

Следуя протоколу интеллектуальной высокопроизводительной системы АСТ, ее применение было проиллюстрировано на примере сальмонеллы домашней птицы в провинции Шаньдун, Китай. Рост штаммов сальмонелл на агаровых пластинах с ампициллином (R 32 мкг/мл) в концентрац…

Discussion

Метод разбавления агаром хорошо зарекомендовал себя и широко используется. Принцип работы высокопроизводительной системы АСТ был основан на методе разбавления агара. Одним из важнейших шагов в рамках протокола была точная высокопроизводительная передача 96 инокулей за один раз, кото?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Национального проекта по ключевым исследованиям и разработкам (2019YFA0904003); Современная сельскохозяйственная промышленная система в провинции Шаньдун (SDAIT-011-09); Проект по оптимизации платформы международного сотрудничества (CXGC2023G15); Основные инновационные задачи сельскохозяйственной науки и техники, инновационный проект Академии сельскохозяйственных наук, Шаньдун, Китай (CXGC2023G03).

Materials

96 well  culture plate Beijing lanjieke Technology Co., Ltd 11510
96-dot matrix AST image acquisition system Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences In-house software copyright
96-dot matrix inoculator  Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences N/A Patented product
Agar Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd HB8274-1
Amikacin  Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd A857053
Amoxicillin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd A822839
Ampicillin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd A830931
Analytical balance Sartorius BSA224S
Automated calculation software for Lar index of AMR Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences In-house software copyright
Bacteria Salmonella strains Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences N/A Animal origin
Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences In-house software copyright
Ceftiofur Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd C873619
Ciprofloxacin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd C824343
Clavulanic acid Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd C824181
Clean worktable Suzhou purification equipment Co., Ltd SW-CJ-2D
Colistin sulfate Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd C805491
Culture plate Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences N/A Patented product
Doxycycline Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd D832390
Enrofloxacin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd E809130
Filter 0.22 μm Millipore SLGP033RB
Florfenicol Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd F809685
Gentamicin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd G810322
Glass bottle 50 mL Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd QX-7
High-throughput resistance detection system V1.0 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences In-house software copyright
Image acquisition converter Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences N/A Patented product
Meropenem Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd M861173
Mueller-Hinton agar Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd HB6232
Petri dish 60 mm x 15 mm Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd 16021-1
Petri dish 90 mm x 15 mm Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd 16001-1
Salmonella phages Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences N/A
Shaker incubator Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd MQD-S2R
Turbidimeter Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd F-TC2015
Varms base type library system V1.0 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences In-house software copyright
Vertical high-pressure steam sterilizer Shanghai Shen'an medical instrument factory LDZX-75L
Veterinary pathogen resistance testing management system Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences In-house software copyright
Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences In-house software copyright

Riferimenti

  1. Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
  2. Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
  3. CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).
  4. Yuqing, L., et al. . Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).
  5. Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
  6. Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
  7. Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
  8. Liu, Y., et al. A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. , (2019).
  9. Liu, Y. A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. , (2022).
  10. Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
  11. Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
  12. . . Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).
  13. Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
  14. Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
  15. Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
  16. Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
  17. Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).

Play Video

Citazione di questo articolo
Hu, M., Liu, Z., Song, Z., Li, L., Zhao, X., Luo, Y., Zhang, Q., Chen, Y., Xu, X., Dong, Y., Hrabchenko, N., Zhang, W., Liu, Y. Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance. J. Vis. Exp. (197), e64785, doi:10.3791/64785 (2023).

View Video