Summary

Свободно плавающее иммуноокрашание мозга мыши

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

Этот протокол описывает эффективный и воспроизводимый подход к гистологическим исследованиям мозга мышей, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию.

Abstract

Иммуногистохимическое окрашивание мозга мыши является рутинным методом, обычно используемым в неврологии для исследования центральных механизмов, лежащих в основе регуляции энергетического обмена и других нейробиологических процессов. Однако качество, надежность и воспроизводимость результатов гистологии мозга могут варьироваться в зависимости от лаборатории. Для каждого эксперимента по окрашиванию необходимо оптимизировать ключевые процедуры, основанные на различиях в видах, тканях, целевых белках и условиях работы реагентов. Эта статья демонстрирует надежный рабочий процесс в деталях, включая внутриаортальную перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию, за которыми могут легко следить исследователи в этой области.

Также обсуждается, как модифицировать эти процедуры для удовлетворения индивидуальных потребностей исследователей. Чтобы проиллюстрировать надежность и эффективность этого протокола, перинейрональные сетки были окрашены биотиновым меченым гглибутинином Wisteria florbunda (WFA) и аргининовым вазопрессином (AVP) антителом против AVP в мозге мыши. Наконец, были рассмотрены критические детали для всей процедуры и преимущества этого протокола по сравнению с другими протоколами. Взятый вместе, в этой статье представлен оптимизированный протокол для свободно плавающего иммуноокрашения ткани мозга мыши. Следование этому протоколу облегчает этот процесс как младшим, так и старшим ученым для улучшения качества, надежности и воспроизводимости иммуноокрашивающих исследований.

Introduction

Распространенность ожирения и связанных с ним сопутствующих заболеваний достигла уровня эпидемии, что приводит к огромному социально-экономическому бремени1,2. Различные мышиные модели были разработаны, чтобы лучше понять биологические процессы, ответственные за ожирение3,4. Поскольку центральные механизмы важны для регуляции энергетического гомеостаза на этих животных моделях, нейроанатомические исследования мозга мышей стали необходимой техникой в этой области. Тем не менее, качество, надежность и воспроизводимость методов гистологии мозга значительно различаются между лабораториями и даже исследователями в одной и той же лаборатории по разным причинам (например, антитела, ткани, методы лечения, виды, цели исследований). Поэтому необходимо установить общий протокол гистологических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, крепление тканей и визуализацию. Между тем, новички могут быстро изучить, освоить и настроить этот протокол для удовлетворения своих индивидуальных потребностей.

Иммуногистохимическое окрашивание является признанным методом, который широко используется для визуализации конкретных типов клеток, мРНК и белков в различных тканях (например, мозге и периферических тканях)5,6. Более конкретно, представляющий интерес антиген может быть меченым специфическим первичным антителом и соответствующим вторичным антителом, связанным с ферментом (например, хромогенной иммуногистохимией) или флуоресцентным красителем (флуоресцеин изотиоцианат)6. В качестве примера полезности этих методов β-эндорфин [один пептид, кодируемый про-опиомеланокортином (POMC)] и c-fos (маркер нейрональной активности) были окрашены в дугообразное ядро. Было показано, что делеция триптофангидроксилазы 2 (фермента, интегрального синтеза серотонина) в дорсальном ядре рафе снижает экспрессию c-fos в нейронах POMC в дугообразном ядре7. Кроме того, распределение мРНК рецептора витамина D было нанесено на карту в мозге мыши посредством гибридизации in situ (RNAscope)8. В данной работе представлен надежный и эффективный метод с пошаговым рабочим процессом для свободно плавающего иммуноокрашения, направленный на улучшение качества и воспроизводимости гистологических исследований мозга мыши.

Protocol

В настоящем исследовании использовались мыши C57BL/6J обоих полов (в возрасте 8-16 недель). Уход за всеми животными и все процедуры были одобрены комитетами по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Бейлора. 1. Перфузия ПРИМЕЧАН?…

Representative Results

Блок-схема этого протокола кратко проиллюстрирована на рисунке 1. Процедура криосечения в этой лаборатории показана на рисунке 2А, в котором 5 образцов мозга были разделены одновременно. Крепление участков мозга показано на рисунке 2B, а п?…

Discussion

Этот протокол обеспечивает установленный метод нейроанатомических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение тканей, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию. Тем не менее, несколько ключевых деталей, необходимых для последовательных и надежных рез…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследователи были поддержаны грантами NIH (K01DK119471 для CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 и R01DK120858 to YX), USDA/CRIS (51000-064-01S to YX) и постдокторская стипендия Американской кардиологической ассоциации (#829565) в LT.

Materials

Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

Riferimenti

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Play Video

Citazione di questo articolo
Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

View Video