Summary

마우스 뇌의 자유 부동 면역 염색

Published: October 07, 2021
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Summary

이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

Abstract

마우스 뇌의 면역 히스토케미칼 염색은 에너지 대사 및 기타 신경 생물학적 과정의 조절의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 신경 과학에 일반적으로 사용되는 일상적인 기술입니다. 그러나, 품질, 신뢰성, 그리고 뇌 역사학 결과의 재현성 실험실 마다 다를 수 있습니다. 각 염색 실험에 대해, 종, 조직, 표적 단백질 및 시약의 작업 조건의 차이에 따라 주요 절차를 최적화할 필요가 있습니다. 이 논문은 대동맥 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 스테인링, 조직 마운팅 및 이미징을 포함하여 신뢰할 수있는 워크플로우를 자세히 보여줍니다.

또한 연구원의 개별적인 필요를 충족시키기 위하여 이 절차를 수정하는 방법 토론입니다. 이 프로토콜의 신뢰성과 효율성을 설명하기 위해, 페리뉴런 그물은 마우스 두뇌에 있는 항 AVP 항체를 가진 비오틴 표지된 Wisteria florbunda agglutinin (WFA) 및 아르기닌 바소프레신 (AVP)로 염색되었습니다. 마지막으로 전체 절차에 대한 중요한 세부 정보가 해결되었으며 이 프로토콜의 이점은 다른 프로토콜과 비교됩니다. 이 논문은 마우스 뇌 조직의 자유로운 부동 면역 염색을 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에 따라 이 과정을 통해 주니어 및 고위 과학자 모두 면역 염색 연구의 품질, 신뢰성 및 재현성을 쉽게 개선할 수 있습니다.

Introduction

비만과 관련 된 comorbidities의 보급은 엄청난 사회 경제적 부담을 일으키는 원인이 되는 전염병 수준에 도달했습니다1,2. 다양한 마우스 모델은 비만에 대한 책임이 있는 생물학적 과정을 더 잘 이해하기 위해 개발되었다3,4. 중앙 메커니즘은 이러한 동물 모델에서 에너지 항상성의 조절에 중요 하기 때문에, 마우스 두뇌의 신경 해부학 연구이 분야에서 필요한 기술이 되었다. 그러나, 뇌 조직학 기술의 품질, 신뢰성 및 재현성은 여러 가지 이유로 실험실 과 심지어 연구자 들 사이에서 상당히 변화 (예를 들어, 항체, 조직, 치료, 종, 연구 목표). 따라서 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌의 조직학적 연구를 위한 일반적인 프로토콜을 수립할 필요가 있다. 한편, 초보자는 신속하게 학습, 마스터, 자신의 개별 요구를 충족하기 위해이 프로토콜을 조정할 수 있습니다.

면역조직화학염색은 다양한 조직(예를 들어, 뇌 및 말초 조직)5,6에서 특정 세포 유형, mRNA 및 단백질을 시각화하기 위해 광범위하게 사용되어 온 확립된 방법입니다. 보다 구체적으로, 관심있는 항원물질은 효소(예를 들어, 염색체 면역히토케미크) 또는 형광염(형광제 이소토오카네이트)6에 연결된 특정 1차 항체 및 대응하는 이차 항체에 의해 표지될 수 있다. 이러한 기술의 유용성의 예로, β-엔돌핀[프로-오피오멜라노코르틴(POMC)] 및 c-fos(뉴런 활성의 마커)에 의해 인코딩된 펩타이드 1개가 아크추아테 핵에 염색되었다. 등쪽 라페 핵에서 트립토판 하이드록실라제 2(세로토닌 합성에 필수적인 효소)의 결실은 arcuate 핵에서 POMC 뉴런에서 c-fos 발현을 감소시키는 것으로 나타났다7. 또한, 비타민 D 수용체 mRNA의 분포는 시투 혼성화(RNAscope)8을 통해 마우스 뇌에 매핑되었다. 이 논문은 마우스 뇌의 조직학 연구의 품질과 재현성을 향상시키는 것을 목표로 자유로운 부동 면역 스테인링을위한 단계별 워크플로우와 신뢰할 수있는 효율적인 방법을 제공합니다.

Protocol

C57BL/6J 마우스는 남녀(8-16주)의 쥐가 본 연구에서 사용되었다. 모든 동물과 모든 절차의 치료는 의학의 베일러 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 관류 참고: 1.1 – 1.6 단계는 연기 후드로 수행됩니다. 마취 이소플루란 5mL( 재료 표 참조)를 건조기 바닥에 놓인 종이 타월에 붓습니다. 건조기 내?…

Representative Results

이 프로토콜의 흐름 차트는 그림 1에 간략하게 설명되어 있습니다. 이 실험실의 극저온 절제 절차는 5개의 두뇌 견본이 동시에 단면된 그림 2A에서 입증됩니다. 뇌 섹션의 장착은 도 2B에 표시되며, 뇌 섹션이 있는 완전히 장착된 슬라이드는 도 2C에 설명되어 있습니다. 도 3에서, 브레그?…

Discussion

이 프로토콜은 관류, 조직 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 장착 및 이미징을 포함한 마우스 뇌의 신경 해부학 적 연구를위한 확립 된 방법을 제공합니다. 그러나 일관되고 신뢰할 수 있는 결과에 필수적인 몇 가지 주요 세부 사항을 최적화해야 합니다.

관류의 품질은 성공적인 염색에 매우 중요합니다. 혈액세포(예: 적혈구)가 인공적인 ‘양성’ 염색10을 생성?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

조사관은 NIH (K01DK119471에서 CW에 대한 보조금)의 보조금으로 지원되었습니다. P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, R01DK125480, R01DK125480 YX), USDA/CRIS (510000-064-01S YX), 미국 하트 펠로우십(51000-064-01S) 및 미국 하트 펠로우십(미국 하트닥터)829565.

Materials

Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

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