Inmunotinción flotante de cerebros de ratón
Summary
Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.
Abstract
La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica rutinaria comúnmente utilizada en neurociencia para investigar los mecanismos centrales subyacentes a la regulación del metabolismo energético y otros procesos neurobiológicos. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de histología cerebral pueden variar entre los laboratorios. Para cada experimento de tinción, es necesario optimizar los procedimientos clave en función de las diferencias en especies, tejidos, proteínas objetivo y las condiciones de trabajo de los reactivos. Este documento demuestra un flujo de trabajo confiable en detalle, que incluye perfusión intraaórtica, seccionamiento cerebral, inmunotinción flotante, montaje de tejidos e imágenes, que pueden ser seguidos fácilmente por investigadores en este campo.
También se discute cómo modificar estos procedimientos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Para ilustrar la fiabilidad y eficiencia de este protocolo, las redes perineuronales se tiñeron con aglutinina Wisteria florbunda marcada con biotina (WFA) y arginina vasopresina (AVP) con un anticuerpo anti-AVP en el cerebro del ratón. Finalmente, se han abordado los detalles críticos para todo el procedimiento, y las ventajas de este protocolo en comparación con las de otros protocolos. En conjunto, este artículo presenta un protocolo optimizado para la inmunotinción flotante del tejido cerebral del ratón. Seguir este protocolo hace que este proceso sea más fácil para los científicos junior y senior para mejorar la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los estudios de inmunotinción.
Introduction
La prevalencia de obesidad y comorbilidades asociadas ha alcanzado niveles epidémicos, causando una tremenda carga socioeconómica1,2. Se han desarrollado diversos modelos de ratón para comprender mejor los procesos biológicos responsables de la obesidad3,4. Debido a que los mecanismos centrales son importantes para la regulación de la homeostasis energética en estos modelos animales, los estudios neuroanatómicos de cerebros de ratón se han convertido en una técnica necesaria en este campo. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de las técnicas de histología cerebral varían considerablemente entre los laboratorios e incluso los investigadores dentro del mismo laboratorio por diversas razones (por ejemplo, anticuerpos, tejidos, tratamientos, especies, objetivos de investigación). Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo general para los estudios histológicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Mientras tanto, los principiantes pueden aprender, dominar y ajustar rápidamente este protocolo para satisfacer sus necesidades individuales.
La tinción inmunohistoquímica es un método establecido que se ha utilizado ampliamente para visualizar tipos específicos de células, ARNm y proteínas en una variedad de tejidos (por ejemplo, tejido cerebral y periférico)5,6. Más específicamente, un antígeno de interés puede ser marcado por un anticuerpo primario específico y un anticuerpo secundario correspondiente vinculado a una enzima (por ejemplo, inmunohistoquímica cromogénica) o un colorante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína)6. Como ejemplo de la utilidad de estas técnicas, β-endorfina [un péptido codificado por pro-opiomelanocortina (POMC)] y c-fos (un marcador de actividad neuronal) se tiñeron en el núcleo arqueado. Se demostró que la deleción de triptófano hidroxilasa 2 (una enzima integral a la síntesis de serotonina) en el núcleo dorsal del rafe disminuye la expresión de c-fos en las neuronas POMC en el núcleo arqueado7. Además, se mapeó la distribución del ARNm del receptor de vitamina D en el cerebro del ratón mediante hibridación in situ (RNAscope)8. Este artículo presenta un método confiable y eficiente con un flujo de trabajo paso a paso para la inmunotinción flotante, con el objetivo de mejorar la calidad y la reproducibilidad de los estudios histológicos del cerebro del ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un método establecido para estudios neuroanatómicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento de tejido, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Sin embargo, se deben optimizar algunos detalles clave esenciales para obtener resultados consistentes y confiables.
La calidad de la perfusión es fundamental para una tinción exitosa. Los resultados de las tinciones podrían verse afectados si la sangre permanece en el …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los investigadores fueron apoyados por subvenciones de los NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 y R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) y American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
Riferimenti
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