Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon
Summary
Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.
Abstract
Fare beyinlerinin immünohistokimyasal lekelenimi, enerji metabolizmasının ve diğer nörobiyolojik süreçlerin düzenlenmesinin altında kalan merkezi mekanizmaları araştırmak için sinirbilimde yaygın olarak kullanılan rutin bir tekniktir. Bununla birlikte, beyin histolojisi sonuçlarının kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği laboratuvarlar arasında değişebilir. Her boyama deneyi için, türler, dokular, hedeflenen proteinler ve reaktiflerin çalışma koşullarındaki farklılıklara göre temel prosedürleri optimize etmek gerekir. Bu makale, bu alandaki araştırmacılar tarafından kolayca takip edilebilen aort içi perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere güvenilir bir iş akışını ayrıntılı olarak göstermektedir.
Ayrıca, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için bu prosedürlerin nasıl değiştirilacağı tartışılmaktadır. Bu protokolün güvenilirliğini ve verimliliğini göstermek için perineuronal ağlar, fare beyninde bir anti-AVP antikoru ile biyotin etiketli Wisteria florbunda agglutinin (WFA) ve arginin vazopressin (AVP) ile boyandı. Son olarak, tüm prosedür için kritik ayrıntılar ve bu protokolün diğer protokollere kıyasla avantajları ele alınmıştır. Birlikte ele alındığında, bu makale fare beyin dokusunun serbest yüzen immünostaining için optimize edilmiş bir protokol sunar. Bu protokolün ardından, hem genç hem de üst düzey bilim adamlarının immünostaining çalışmalarının kalitesini, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmaları için bu süreci kolaylaştırır.
Introduction
Obezite ve buna bağlı komorbiditelerin yaygınlığı salgın boyutlara ulaşmış ve muazzam bir sosyoekonomik yüke neden olmuştur1,2. Obeziteden sorumlu biyolojik süreçleri daha iyi anlamak için çeşitli fare modelleri geliştirilmiştir3,4. Bu hayvan modellerinde enerji homeostazının düzenlenmesi için merkezi mekanizmalar önemli olduğundan, fare beyinlerinin nöroanatomik çalışmaları bu alanda gerekli bir teknik haline gelmiştir. Bununla birlikte, beyin histolojisi tekniklerinin kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, çeşitli nedenlerle (örneğin antikorlar, dokular, tedaviler, türler, araştırma hedefleri) aynı laboratuvardaki laboratuvarlar ve hatta araştırmacılar arasında önemli ölçüde değişmektedir. Bu nedenle, fare beyninin histolojik çalışmaları için perfüzyon, beyin kesiği, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere genel bir protokol oluşturmak gerekir. Bu arada, yeni başlayanlar bu protokolü bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için hızlı bir şekilde öğrenebilir, ustalaşabilir ve ayarlayabilir.
İmmünistokimyasal boyama, çeşitli dokularda (örneğin beyin ve periferik dokular) belirli hücre tiplerini, mRNA’ları ve proteinleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan yerleşik bir yöntemdir 5,6. Daha spesifik olarak, ilgi çekici bir antijen, belirli bir birincil antikor ve bir enzime (örneğin, kromojenik immünhistokimya) veya floresan bir boyaya (floresan izotiyosiyanat) bağlı ikincil bir antikor ile etiketlenebilir 6. Bu tekniklerin faydasına örnek olarak, β-endorfin [pro-opiomelanocortin (POMC) ile kodlanmış bir peptit] ve c-fos (nöronal aktivitenin bir belirteci) arcuate çekirdeğinde lekelendi. Dorsal raphe çekirdeğinde triptofan hidroksilaz 2’nin (serotonin sentezine entegre bir enzim) silinmesinin, arcuate çekirdeğindeki POMC nöronlarında c-fos ekspresyonunun azaldığı gösterilmiştir7. Ek olarak, D vitamini reseptör mRNA’nın dağılımı in situ hibridizasyon (RNAscope)8 ile fare beyninde haritalandı. Bu makale, fare beyninin histolojik çalışmalarının kalitesini ve tekrarlanabilirliğini artırmayı amaçlayan, serbest yüzen immünostaining için adım adım bir iş akışı ile güvenilir ve verimli bir yöntem sunun.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, fare beyninin perfüzyon, doku kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere nöroanatomik çalışmaları için yerleşik bir yöntem sağlar. Ancak, tutarlı ve güvenilir sonuçlar için gerekli olan birkaç temel ayrıntı optimize edilmelidir.
Perfüzyon kalitesi başarılı boyama için kritik öneme sahiptir. Kan hücrelerinin (örneğin, kırmızı kan hücreleri) yapay bir ‘pozitif’ boyama üretebileceği göz önüne alındı?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırmacılar NIH’den (K01DK119471’den CW’ye; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 ve R01DK120858’den YX’e), USDA/CRIS (51000-064-01S’den YX’e) ve Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (#829565) LT’ye.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
Riferimenti
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
