En este protocolo se describe un método de cultivo y análisis funcional in vitro para células madre musculares, que conserva la mayoría de sus interacciones con su nicho endógeno.
El tejido muscular esquelético adulto alberga una población de células madre que es indispensable para su capacidad de regenerarse. Tras el daño muscular, las células madre musculares abandonan su estado de reposo y activan el programa miogénico que finalmente conduce a la reparación del tejido dañado concomitante con la reposición del grupo de células madre musculares. Varios factores influyen en la actividad de las células madre musculares, entre ellos los estímulos intrínsecos, pero también las señales del entorno directo de las células madre musculares, el nicho de las células madre. El aislamiento y cultivo de miofibras individuales con sus células madre musculares asociadas preserva la mayor parte de la interacción de la célula madre con su nicho y, por lo tanto, es la posibilidad más cercana para estudiar la funcionalidad de las células madre musculares ex vivo. Aquí, se proporciona un protocolo para el aislamiento, cultivo, transfección de siRNA e inmunotinción de células madre musculares en sus respectivas miofiberes de los músculos EDL(extensor digitorum longus)de ratón. Las condiciones experimentales descritas aquí permiten el estudio y la manipulación de las células madre musculares ex vivo, incluida la investigación de la actividad miogénica sin la necesidad inherente de experimentos in vivo con animales.
El músculo esquelético en el adulto es un tejido postmitótico compuesto principalmente por miofibras multinucleadas, que son las células efectoras de los movimientos voluntarios. Tiene una notable capacidad de regeneración, un proceso que se asemeja a la miogénesis embrionaria y sufre deficiencias en la edad y la enfermedad1. Esta sorprendente capacidad regenerativa del músculo esquelético depende de las células madre musculares (MuSC), que también se denominan células satélite debido a su ubicación entre el sarcolema y la lámina basal de las miofiberes2,3. En condiciones de reposo, los MuSC son quiescentes y se caracterizan por la expresión del factor de transcripción Pax7 y marcadores de inactividad como Sprouty14,5,6,7,8. Tras la activación, por ejemplo, después de una lesión, las MuSC abandonan el estado de reposo y regulan al alza el factor regulador miogénico MyoD9. Las MuSCs doblemente positivas Pax7/MyoD proliferan y se diferencian generando así células precursoras miogénicas, que a menudo también se denominan mioblastos. Esos mioblastos luego se diferencian aún más en miocitos alargados, un proceso que coincide con cambios moleculares y morfológicos, por ejemplo, pérdida de Pax7 y regulación ascendente de la expresión de miogenina10. Los miocitos eventualmente se fusionan entre sí o con las miofibras existentes, reparando así el tejido dañado. Es importante destacar que una pequeña fracción de células madre musculares revierte la regulación ascendente de MyoD y es capaz de autorrenovarse11. El estado de la diferenciación de MuSC y la progresión miogénica se pueden observar fácilmente mediante la investigación de marcadores miogénicos como Pax7, MyoD y Myogenin10.
El cultivo de miofibras individuales con sus MuSCs adyacentes es un excelente método para investigar la funcionalidad de MuSC en un entorno ex vivo, ya que las MuSC permanecen en su nicho endógeno12,13. El comportamiento de las MuSC está regulado por señales intrínsecas, así como por señales extrínsecas proporcionadas por el nicho, una ubicación anatómica especializada que comprende componentes de la matriz extracelular (ECM) que rodea las MuSC y la propia miofibra. Por ejemplo, uno de los reguladores extrínsecos de la inactividad MuSC es la señalización Notch. Aquí, las señales de señalización son recibidas por muSC tanto del myofiber como del ECM14,15,16. Además, el nicho MuSC es importante para controlar el eje de división de muSCs regulando así el destino celular de las células hijas MuSC17,18. Razonablemente, parámetros como las divisiones asimétricas de MuSC, la progresión miogénica y la autorrenovación se pueden evaluar de manera única en esta configuración experimental. Por ejemplo, se puede formar un grupo multicelular que surge de un MuSC después de un período de cultivo de 72 h, que puede investigarse para la aparición y el porcentaje de poblaciones miogénicas distintas, como las MuSC auto-renovadoras, proliferantes y diferenciadas8,19,20,21. El estado de diferenciación de las MuSCs puede determinarse mediante la investigación de la expresión/coexpresión de Pax7, MyoD y Myogenin. Después de 72 h de cultivo, las células de un grupo pueden ser discriminadas por los siguientes parámetros: Pax7 solo las células son MuSC autorrenovadoras, mientras que las células dobles positivas Pax7 / MyoD están proliferando / activadas MuSC y las células miogénicas diferenciadas son Myogeninpositivas 22. Además, los números de MuSC o la reentrada en el ciclo/activación celular pueden investigarse además de la progresión miogénica, por ejemplo, a través de análisis basados en inmunofluorescencia basados en los parámetros descritos anteriormente.
Aquí, se describen las características únicas del protocolo de aislamiento y cultivo de myofiber, por ejemplo, la preservación de la interacción del MuSC con su nicho. Los músculos enteros de EDL(extensor digitorum longus)del ratón se diseccionan cuidadosamente, se digieren mediante colagenasa y se trituran físicamente para obtener miofibras individuales con sus MuSC asociadas para un mayor cultivo. Además, el protocolo delinea los pasos para transfectar MuSCs con siRNA para análisis funcionales de genes candidatos y análisis consecutivos basados en inmunofluorescencia sin la necesidad de animales transgénicos.
Aquí, se presenta un método para investigar funcionalmente el papel de un gen específico en las MuSC utilizando un enfoque in vitro. Es importante destacar que en el sistema descrito aquí, los MuSC se cultivan en condiciones, que se asemejan a la situación in vivo tanto como sea posible, preservando la mayoría de las interacciones de los MuSC con su nicho. Esto se logra cultivando miofibras aisladas con sus MuSC adyacentes en condiciones de flotación y transfección consecutiva de siRNA. Se describen los procedimientos de aislamiento de miofibra, transfección de siRNA e investigación de poblaciones de MuSC durante 72 h de cultivo mediante análisis de inmunofluorescencia. Además, se demostró que alrededor del 74% de todas las MuSC fueron transfectadas con un siRNA de control marcado fluorescentemente después de 30 h de cultivo.
Se debe prestar especial atención a la disección cuidadosa del músculo EDL, ya que el estiramiento extenso, el pellizco o la compresión conducirán a la contracción y la muerte consecutiva de las miofiberes. Además, es importante investigar grupos de MuSC de al menos 20 miofiberes diferentes por réplica por condición. Esto es necesario ya que los números y propiedades de MuSC varían debido a la existencia de subpoblaciones de MuSC. Al investigar el efecto de un siRNA específico en muSC utilizando el método de cultivo flotante de miofibra, se debe realizar una comparación de la condición con el siRNA objetivo con el control no objetivo dentro del mismo ratón y músculo. Esto se recomienda para evitar diferencias específicas del ratón que podrían cubrir o amplificar los efectos del siRNA. La eficiencia de derribo se puede determinar mediante análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos dirigidos contra el gen objetivo utilizando miofiberes individuales con sus MuSC adyacentes. Si esto no es una opción, se puede probar la eficiencia de eliminación de siRNA en mioblastos primarios seguido de RT-PCR cuantitativa o análisis de inmunoblot. La eficiencia del siRNA debe determinarse antes de analizar el efecto del siRNA en muSCs en miofiberes individuales. El uso de un grupo inteligente que consta de 4 siRNAs diferentes frente a uno solo aumenta la eficiencia de derribo, pero también aumenta el riesgo de una orientación inespecífica. Se debe utilizar un siRNA no dirigido como control. Para monitorear directamente la eficiencia de la transfección, se puede usar un siRNA no dirigido marcado fluorescentemente como se realiza aquí. El punto de tiempo para la transfección con el siRNA es de alrededor de 4 horas después del aislamiento, un punto de tiempo en el que la lámina basal que rodea las MuSC ya es permeable para el siRNA. Si se debe investigar el efecto de un siRNA específico sobre muSCs después de 72 o 96 h, se recomienda realizar una segunda transfección de siRNA después de 24 h o 48 h para mantener una alta eficiencia de derribo.
El ensayo de cultivo de myofiber muestra diversas ventajas en comparación con la investigación de MuSCs con métodos convencionales de cultivo celular. Los MuSC permanecen unidos a los miofiberes durante todo el proceso de aislamiento, preservando así la interacción crucial del MuSC con su nicho19,23,24,25. La interacción preservada de muSC con el myofiber es un requisito previo para estudiar los efectos dependientes de nicho en la funcionalidad de MuSC, que no se pueden recapitular en cultivos de mioblastos 2D convencionales. Por ejemplo, durante el envejecimiento, las MuSC muestran una capacidad miogénica deteriorada, lo que resulta en una eficiencia reducida para regenerar el tejido muscular después del daño20,26. Este deterioro es al menos parcialmente atribuible a cambios en el nicho muSC, en particular cambios en la composición ecm27,28. El protocolo de cultivo myofiber permite el estudio y la interferencia con estos cambios aberrantes de nicho.
En contraste con el método descrito aquí, la purificación de MuSCs por técnicas de inmunoetiquetado y clasificación como FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) o MACS (clasificación de células magnéticas) implica la eliminación de las MuSC de su nicho. Curiosamente, los cultivos 2D de MuSCs aislados de músculos envejecidos pierden sus señales extrínsecas y se comportan de manera similar a muSCs aislados de músculos jóvenes, por lo que no recapitulan la situación in vivo de manera adecuada29. Además, la disociación completa del tejido muscular y el etiquetado de MuSCs con marcadores de superficie da como resultado cambios transcriptómicos y activación de las células30,31,32. Otra ventaja del sistema de cultivo myofiber es la posibilidad de interferir con la funcionalidad muSC en varios niveles. La manipulación de MuSCs en miofibras cultivadas se puede lograr de manera efectiva mediante la eliminación de genes mediada por siRNA como se describe aquí en detalle. Asimismo, la aplicación de compuestos químicos o la entrega de proteínas recombinantes es muy eficaz para interferir con las vías de las células madre20,28. Además, los vectores de expresión retro o lentiviral permiten la introducción de genes exógenos, es decir, mutantes activos constitutivos33. Además, la influencia de los factores extrínsecos en la funcionalidad de MuSC se puede explorar en el sistema descrito aquí, por ejemplo, las condiciones de cultivo se pueden complementar con sobrenadante de diferentes fuentes fisiológicas o patológicas para modelar diferentes estados como la caquexia del cáncer34,35.
Una limitación del método descrito aquí es el hecho de que el sistema de cultivo único de miofiber no puede recapitular completamente el impacto de todos los factores sistémicos o la influencia de otros tipos de células en las MuSC. Además, el tiempo en el que las miofibras pueden mantenerse viables en cultivo es limitado y, por lo tanto, el estudio de los procesos relacionados con MuSC se centra en eventos tempranos como la activación y el compromiso miogénico. Además, la investigación de la interacción muSC con otras células de nicho como las células inmunes o las células progenitoras fibro-adipogénicas no es posible. Para investigar los efectos sistémicos sobre la funcionalidad del MuSC se pueden realizar experimentos de lesión muscular seguidos del análisis de la regeneración muscular in vivo o realizar experimentos de trasplante36,37.
En conjunto, el protocolo de aislamiento y cultivo de myofiber ofrece una gran oportunidad para estudios genéticos o mecanicistas en MuSC adultos sin el requisito de modelos de ratones transgénicos y puede reducir potencialmente la experimentación con animales.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Christine Poser y Christina Picker por su excelente asistencia técnica y lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a JvM (MA-3975/2-1), la fundación Carl Zeiss y la Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
horse serum | Gibco | 26050-088 | |
Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |