בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.
רקמת שריר השלד הבוגרת מכילה אוכלוסיית תאי גזע החיונית ליכולתה להתחדש. לאחר נזק לשרירים, תאי גזע שריר לעזוב את מצבם העגום ולהפעיל את התוכנית myogenic בסופו של דבר מוביל לתיקון של רקמה פגומה במקביל לחידוש מאגר תאי גזע השריר. גורמים שונים משפיעים על פעילות תאי הגזע של השריר, ביניהם גירויים מהותיים אך גם איתותים מסביבת תאי הגזע של השריר הישיר, נישה של תאי גזע. הבידוד והתרבות של myofibers יחיד עם תאי גזע השריר הקשורים שלהם משמר את רוב האינטראקציה של תא הגזע עם הנישה שלה, ולכן, האפשרות הקרובה ביותר ללמוד פונקציונליות תאי גזע שריר ex vivo. כאן, פרוטוקול לבידוד, תרבית, transfection siRNA וחיסון של תאי גזע שריר על myofibers בהתאמה שלהם מן העכבר EDL (extensor digitorum longus) השרירים מסופקים. התנאים הניסיוניים המתוארים כאן מאפשרים מחקר ומניפולציה של תאי גזע שריר ex vivo כולל חקירה של פעילות מיוגנית ללא צורך מובנה בניסויים בבעלי חיים vivo.
שריר השלד במבוגר הוא רקמה פוסט-מיטוטית המורכבת בעיקר ממיאופייברים רב-גרעיניים, שהם תאי האפקטיביות לתנועות מרצון. יש לו יכולת יוצאת דופן להתחדש, תהליך הדומה מיוגנזה עוברית ועובר ליקויים בגיל ובמחלה1. יכולת רגנרטיבית מרשימה זו של שריר השלד תלויה בתאי גזע שריריים (MuSCs), המכונים גם תאי לוויין בשל מיקומם בין הסרקולמה לבין הלמינה הבזלית של myofibers2,3. בתנאי מנוחה MuSCs הם שבתים ומאופיינים בביטוי של גורם שעתוק Pax7 וסמני השהיה כגון Sprouty14,5,6,7,8. עם ההפעלה, למשל, לאחר פציעה, MuSCs לעזוב את המצב העגום ולהגדיל את גורם הרגולציה myogenic MyoD9. ה- Pax7 / MyoD כפול חיובי MuSCs להתרבות ולהבדיל ובכך לייצר תאי מבשר מיוגניים, אשר מכונים לעתים קרובות גם myoblasts. מיובלסטים אלה מבדילים עוד יותר לתוך מיוציטים מוארכים, תהליך במקביל לשינויים מולקולריים ומורפולוגיים, למשל, אובדן Pax7 ועלייה בביטוי מיוגנין10. מיוציטים בסופו של דבר להתיך זה לזה או myofibers הקיים ובכך לתקן את הרקמה הפגועה. חשוב לציין, חלק קטן מתאי גזע השרירים חוזר לתרומת MyoD ומסוגל לחדש את עצמו11. המצב של בידול MuSC והתקדמות מיוגנית ניתן לראות בקלות על ידי חקירה של סמנים מיוגניים כגון Pax7, MyoD ומיוגנין10.
התרבות של myofibers יחיד עם MuSCs הסמוך שלהם היא שיטה מצוינת לחקור פונקציונליות MuSC בסביבה ex vivo מאז MuSCs נשארים בנישה אנדוגנית שלהם12,13. ההתנהגות של MuSCs מווסתת על ידי אותות מהותיים, כמו גם אותות קיצוניים המסופקים על ידי הנישה, מיקום אנטומי מיוחד הכולל רכיבים של המטריצה החוץ תאית (ECM) המקיפה את MuSCs ואת myofiber עצמו. לדוגמה, אחד הרגולטורים הקיצוניים של מייסת MuSC הוא איתות חריץ.” כאן, רמזי איתות מתקבלים על ידי MuSCs הן מן myofiber ואת ECM14,15,16. יתר על כן, נישה MuSC חשוב לשלוט על ציר החלוקה של MuSCs ובכך להסדיר את גורל התא של תאי הבת MuSC17,18. באופן סביר, פרמטרים כמו חטיבות MuSC אסימטריות, התקדמות מיוגנית וחידוש עצמי ניתן להעריך באופן ייחודי במערך ניסיוני זה. לדוגמה, אשכול רב-תאי יכול להיווצר כתוצאה מ- MuSC אחד לאחר תקופת תרבות של 72 שעות, אשר ניתן לחקור על התרחשות ואחוז האוכלוסיות המיוגניות המובהקות כגון חידוש עצמי, התפשטות ומבדלים נוספים MuSCs8,19,20,21. מצב הבידול של MuSCs יכול להיקבע על ידי חקירה של הביטוי / ביטוי משותף של Pax7, MyoD ומיוגנין. לאחר 72 שעות של תרבית התאים באשכול יכולים להיות מופלים על ידי הפרמטרים הבאים: Pax7 רק תאים הם MuSCs חידוש עצמי, בעוד Pax7 / MyoD תאים חיוביים כפולים מתרבים / מופעלים MuSCs ותאים מיוגניים מובחנים עוד יותר הם Myogenin חיובי22. יתר על כן, מספרי MuSC או כניסה מחדש לתוך מחזור התא / הפעלה ניתן לחקור בנוסף התקדמות מיוגנית, למשל, באמצעות ניתוחים מבוססי אימונופלואורסצנטיות המבוססים על הפרמטרים שתוארו לעיל.
כאן, המאפיינים הייחודיים של פרוטוקול הבידוד והתרבות של מיופיבר, למשל, שימור האינטראקציה של MuSC עם הנישה שלו, מתוארים. עכבר שלם EDL (extensor digitorum longus) השרירים נותחו בקפידה, מתעכלים על ידי collagenase, ו triturated פיזית כדי להשיג myofibers יחיד עם MuSCs הקשורים שלהם לתרבות נוספת. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר את הצעדים כדי להעביר MuSCs עם siRNA עבור ניתוחים פונקציונליים של גנים מועמדים ניתוחים מבוססי אימונופלואורסצנטיות רצופים ללא צורך בבעלי חיים מהונדסים.
כאן מוצגת שיטה לחקור פונקציונלית את תפקידו של גן מסוים ב- MuSCs באמצעות גישה במבחנה. חשוב לציין, במערכת המתוארת כאן MuSCs הם תרבותיים בתנאים, הדומים למצב in vivo ככל האפשר שמירה על רוב האינטראקציות של MuSCs עם הנישה שלהם. זה מושג על ידי פולחן myofibers מבודד עם MuSCs הסמוכים שלהם בתנאים צפים ו transfection siRNA ברציפות. הנהלים של בידוד מיופיבר, התפשטות siRNA וחקירה של אוכלוסיות MuSC במהלך 72 שעות של תרבות באמצעות ניתוחים אימונופלואורסצנטיים מתוארים. יתר על כן, הוכח כי כ -74% מכלל MuSCs הועברו עם siRNA שליטה פלואורסצנטרי לאחר 30 שעות של תרבות.
תשומת לב מיוחדת צריכה להיות ממוקדת על ניתוח זהיר של שריר EDL מאז מתיחה נרחבת, צביטה, או סחיטה יוביל התכווצות ומוות רצופה של myofibers. יתר על כן, חשוב לחקור אשכולות של MuSCs מלפחות 20 myofibers שונים לכל שכפול לכל תנאי. זה הכרחי מאז מספרי MuSC ומאפיינים משתנים בשל קיומו של MuSC תת אוכלוסין. בעת חקירת ההשפעה של siRNA ספציפי על MuSCs באמצעות שיטת התרבות myofiber צף השוואה של המצב עם siRNA מיקוד לבקרת אי-פילוח צריך להתבצע בתוך אותו עכבר ושריר. מומלץ להימנע מהבדלים ספציפיים לעכבר שעשויים לכסות או להגביר את ההשפעות של ה- siRNA. יעילות הנוקאאוט יכולה להיקבע על ידי ניתוחים חיסוניים עם נוגדנים המכוונים נגד גן המטרה באמצעות מיופיברים בודדים עם ה- MuSCs הסמוכים שלהם. אם זו לא אפשרות, ניתן לבדוק את יעילות ההשבתה של siRNA במימובלסטים ראשוניים ואחריו ניתוחים כמותיים של RT-PCR או אימונובלוט. יש לקבוע את היעילות של ה-siRNA לפני ניתוח ההשפעה של ה-siRNA על MuSCs על מיופיברים בודדים. השימוש במאגר חכם המורכב מ-4 siRNAs שונים לעומת מאגר יחיד מגביר את יעילות הנוקאאוט אך גם מגביר את הסיכון לפילוח לא מפורש. יש להשתמש ב- siRNA שאינו מיקוד כפקד. כדי לפקח ישירות על יעילות ההדבקה, ניתן להשתמש בסירנתן שאינה מכוונת באופן פלואורסצנטי כפי שבוצע כאן. נקודת הזמן לתעבורה עם siRNA היא כ -4 שעות לאחר הבידוד, נקודת זמן שבה לאמינה בזאלית המקיפה את ה- MuSCs כבר חדירה לסירנ”א. אם יש לחקור את ההשפעה של siRNA ספציפי על MuSCs לאחר 72 או 96 שעות, מומלץ לבצע טרנספקטציה siRNA שנייה לאחר 24 שעות או 48 שעות כדי לשמור על יעילות נוקאאוט גבוהה.
בדיקת תרבות myofiber מציג יתרונות מגוונים לעומת החקירה של MuSCs עם שיטות תרבות תאים קונבנציונליות. MuSCs להישאר מחובר myofibers במהלך כל תהליך הבידוד, ובכך לשמר את האינטראקציה המכריעה של MuSC עם הנישה שלה19,23,24,25. האינטראקציה המשומרת של MuSCs עם myofiber הוא תנאי מוקדם לחקר השפעות תלויות נישה על פונקציונליות MuSC, אשר לא ניתן לשחזר בתרבויות מיובלסט דו-ממדי קונבנציונאלי. לדוגמה, במהלך הזדקנות MuSCs להציג פגיעה קיבולת מיוגנית וכתוצאה מכך יעילות מופחתת כדי לחדש רקמת שריר לאחר נזק20,26. ליקוי זה מיוחס לפחות חלקית לשינויים בנישה MuSC, בפרט שינויים בהרכב ECM27,28. פרוטוקול תרבות מיופיבר מאפשר את המחקר והפרעה לשינויי נישה חריגים אלה.
בניגוד לשיטה המתוארת כאן, טיהור של MuSCs על ידי טכניקות אימונולאבליזציה ומיון כמו FACS (מיון תאים מופעל פלואורסצנטיות) או MACS (מיון תאים מגנטיים) כרוך בהסרת MuSCs מהנישה שלהם. מעניין, תרבויות 2D של MuSCs מבודדים משרירים מיושנים מאבדים את הרמזים הקיצוניים שלהם ומתנהגים בדומה ל- MuSCs מבודדים משרירים צעירים ובכך לא לשחזר את מצב in vivo כראוי29. יתר על כן, ניתוק מלא של רקמת השריר ותיוג של MuSCs עם סמני פני השטח גורמים לשינויים transcriptomic והפעלה של התאים30,31,32. יתרון נוסף של מערכת התרבות myofiber הוא האפשרות להפריע פונקציונליות MuSC ברמות שונות. מניפולציה של MuSCs על myofibers תרבותי יכול להיות מושגת ביעילות על ידי נוק-אאוט גנים בתיווך siRNA כפי שתואר כאן בפירוט. כמו כן, היישום של תרכובות כימיות או משלוח של חלבונים רקומביננטיים יעיל מאוד להפריע למסלולי תאי גזע20,28. יתר על כן, וקטורים לביטוי רטרו או lentiviral לאפשר את כניסתם של גנים אקסוגניים, כלומר, מוטציות פעילות המרכיבות33. בנוסף, ניתן לחקור את ההשפעה של גורמים קיצוניים על פונקציונליות MuSC במערכת המתוארת כאן, למשל, ניתן להשלים את תנאי התרבות עם supernatant ממקורות פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים למודל מצבים שונים כמו cachexia סרטן34,35.
מגבלה אחת של השיטה המתוארת כאן היא העובדה, כי מערכת התרבות myofiber יחיד לא יכול לשחזר לחלוטין את ההשפעה של כל הגורמים המערכתיים או השפעה של סוגי תאים אחרים על MuSCs. כמו כן, הזמן שבו myofibers ניתן לשמור קיימא בתרבות מוגבל ולכן המחקר של תהליכים הקשורים MuSC מתמקד באירועים מוקדמים כמו הפעלה ומחויבות מיוגנית. יתר על כן, החקירה של אינטראקציית MuSC עם תאים נישה אחרים כגון תאי מערכת החיסון או תאי אבות פיברו-אדיפוגניים אינה אפשרית. כדי לחקור השפעות מערכתיות על פונקציונליות MuSC ניתן לבצע ניסויים בפציעות שרירים ואחריו ניתוח של התחדשות שרירים ב vivo או לבצע ניסויי השתלה36,37.
יחד, פרוטוקול הבידוד והתרבות של מיופיבר מספק הזדמנות נהדרת למחקרים גנטיים או מכניים על MuSCs למבוגרים ללא דרישה של מודלים עכבר מהונדסים ויכול להפחית ניסויים בבעלי חיים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכריסטין פוזר וכריסטינה פיקר על סיוע טכני מצוין וקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מדויטשה פורשונגסגמיינסכאפט ל- JvM (MA-3975/2-1), קרן קרל זייס ודויטשה קרבשילף (DKH-JvM-861005).
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
horse serum | Gibco | 26050-088 | |
Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |