واحد Myofiber الثقافة المقايسة لتقييم وظائف الخلايا الجذعية العضلات الكبار Ex Vivo
Summary
في هذا البروتوكول يتم وصف طريقة زراعة في المختبر والتحليل الوظيفي للخلايا الجذعية العضلية ، والتي تحافظ على معظم تفاعلاتها مع مكانتها الذاتية.
Abstract
أنسجة العضلات الهيكل العظمي الكبار تؤوي مجموعة من الخلايا الجذعية التي لا غنى عنها لقدرتها على تجديد. عند تلف العضلات، والخلايا الجذعية العضلات ترك حالتها هادئة وتفعيل برنامج الميوجينيك مما يؤدي في نهاية المطاف إلى إصلاح الأنسجة التالفة المصاحبة لتجديد تجمع الخلايا الجذعية العضلات. عوامل مختلفة تؤثر على نشاط الخلايا الجذعية العضلات, من بينها المحفزات الجوهرية ولكن أيضا إشارات من بيئة الخلايا الجذعية العضلات المباشرة, مكانة الخلايا الجذعية. عزل وثقافة الألياف العضلية واحدة مع الخلايا الجذعية العضلية المرتبطة بها يحافظ على معظم التفاعل من الخلايا الجذعية مع مكانتها، وبالتالي، فإن أقرب إمكانية لدراسة وظائف الخلايا الجذعية العضلات السابقين فيفو. هنا، يتم توفير بروتوكول للعزلة والثقافة، ونقل سيرنا و المناعة من الخلايا الجذعية العضلية على الألياف العضلية الخاصة بهم من الماوس EDL(أونسور digitorum longus)العضلات. تسمح الظروف التجريبية المبينة هنا بدراسة الخلايا الجذعية العضلية والتلاعب بها بما في ذلك التحقيق في النشاط العضلي دون الحاجة المتأصلة في التجارب الحيوانية الحية.
Introduction
العضلات الهيكل العظمي في الكبار هو نسيج ما بعد الدييتوتيك تتألف أساسا من الألياف العضلية متعددة النوى، والتي هي الخلايا التأثيرية للحركات الطوعية. لديها قدرة ملحوظة على تجديد، وهي عملية تشبه تكوين الجنين ويخضع لضعف في العمر والمرض1. هذه القدرة التجديدية ضرب من العضلات الهيكل العظمي يعتمد على الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs), والتي تسمى أيضا خلايا الأقمار الصناعية بسبب موقعها بين ساركوليما والصفائح القاعدية من الألياف العضلية2,3. تحت ظروف الراحة MuSCs هادئة وتتميز التعبير عن عامل النسخ Pax7 وعلامات quiescence مثل Sprouty14،5،6،7،8. عند التنشيط ، على سبيل المثال ، بعد الإصابة ، تغادر MuSCs الحالة الكئية و upregulate العامل التنظيمي myogenic MyoD9. وPax7/MyoD مزدوجة إيجابية MuSCs تتكاثر وتفرق وبالتالي توليد الخلايا السلائف الميوجينية، والتي غالبا ما يشار إليها أيضا باسم الخلايا الميوبلاستية. تلك الخلايا العضلية ثم مزيد من التفريق إلى myocytes ممدود، وهي عملية تتزامن مع التغيرات الجزيئية والمورفولوجية، على سبيل المثال، وفقدان Pax7 و upregulation التعبير الميوجين10. الخلايا العضلية ثم في نهاية المطاف الصمامات لبعضها البعض أو إلى الألياف العضلية الموجودة وبالتالي إصلاح الأنسجة التالفة. الأهم من ذلك، جزء صغير من الخلايا الجذعية العضلات يعود ال MyoD upregulation وقادرة على تجديد الذات11. يمكن ملاحظة حالة التمايز MuSC والتقدم العضلي بسهولة عن طريق التحقيق في علامات الميوجيني مثل Pax7 و MyoD و Myogenin10.
ثقافة الألياف العضلية واحدة مع MuSCs المجاورة لها هو وسيلة ممتازة للتحقيق في وظائف MuSC في الإعداد السابق فيفو منذ MuSCs تبقى في مكانتها الذاتية12،13. وينظم سلوك MuSCs من خلال إشارات جوهرية وكذلك إشارات خارجية التي تقدمها المتخصصة، وهو موقع تشريحي متخصص يتألف من مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) المحيطة MuSCs وميوفير نفسها. على سبيل المثال ، واحدة من المنظمين extrinsic من الهدوء MuSC هو نوتش الإشارات. هنا، يتم تلقي إشارات الإشارات من قبل MuSCs من كل من الألياف العضلية وECM14،15،16. وعلاوة على ذلك، فإن المتخصصة MuSC مهم للسيطرة على محور تقسيم MuSCs وبالتالي تنظيم مصير الخلية من الخلايا ابنة موسك17،18. بشكل معقول ، يمكن تقييم المعلمات مثل أقسام MuSC غير المتماثلة والتقدم العضلي والتجديد الذاتي بشكل فريد في هذا الإعداد التجريبي. على سبيل المثال، يمكن أن تتشكل مجموعة متعددة الخلايا ناشئة عن MuSC واحد بعد فترة ثقافة 72 ساعة، والتي يمكن التحقيق فيها لحدوث ونسبة مئوية من السكان العضلية متميزة مثل تجديد الذات، وتكاثرها والمزيد من MuSCs8،19،20،21. يمكن تحديد حالة التمايز في MuSCs من خلال التحقيق في التعبير / التعبير المشترك عن Pax7 و MyoD و Myogenin. بعد 72 ح من الثقافة يمكن التمييز بين الخلايا في مجموعة من المعلمات التالية: Pax7 الخلايا فقط هي MuSCs ذاتية التجديد، في حين أن الخلايا الإيجابية المزدوجة Pax7/MyoD تتكاثر / تنشيط MuSCs والمزيد من الخلايا الميوجينية المتمايزةإيجابية 22. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقيق في أرقام الموسك أو العودة إلى دورة/تنشيط الخلية بالإضافة إلى التقدم العضلي المنشأ، على سبيل المثال، من خلال التحليلات القائمة على المناعة استنادا إلى المعلمات الموصوفة أعلاه.
هنا ، يتم وصف السمات الفريدة لبروتوكول العزل والثقافة myofiber ، على سبيل المثال ، الحفاظ على تفاعل MuSC مع مكانتها. الماوس كله EDL (extensor digitorum longus) يتم تشريح العضلات بعناية، هضمها collagenase، وتريتويد جسديا للحصول على الألياف العضلية واحدة مع MuSCs المرتبطة بها لمزيد من الثقافة. وعلاوة على ذلك، يحدد البروتوكول الخطوات اللازمة لترجيح المركبات المخاطية مع الحمض النووي الريبي لإجراء تحليلات وظيفية للجينات المرشحة والتحليلات المتتالية القائمة على المناعة دون الحاجة إلى معدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يتم تقديم طريقة للتحقيق وظيفيا دور جين معين في MuSCs باستخدام نهج في المختبر. الأهم من ذلك ، في النظام الموصوف هنا يتم استزراع MuSCs في ظروف تشبه الوضع في الجسم الحي قدر الإمكان الحفاظ على معظم تفاعلات MuSCs مع مكانتها. ويتم ذلك عن طريق زراعة الألياف العضلية المعزولة مع MuSCs المجاورة لها في ظل ظروف عائمة وتوريث سيرنا المتتالي. ويرد وصف لإجراءات عزل الألياف العضلية، ونقل الحمض النووي الريبي ( siRNA) والتحقيق في مجموعات MuSC خلال 72 ساعة من الثقافة من خلال تحليلات الفلورسينس المناعي. وعلاوة على ذلك، ثبت أن حوالي 74٪ من جميع MuSCs تم تحويلها مع siRNA التحكم المسمى الفلورسنت بعد 30 ساعة من الثقافة.
وينبغي تركيز اهتمام خاص على تشريح دقيق للعضلات EDL منذ تمتد واسعة النطاق, معسر, أو الضغط سيؤدي إلى انكماش والموت المتتالي من الألياف العضلية. وعلاوة على ذلك، من المهم التحقيق في مجموعات من MuSCs من ما لا يقل عن 20 ألياف ميو فايبر مختلفة لكل تكرار لكل حالة. وهذا ضروري لأن أرقام وخصائص MuSC تختلف بسبب وجود مجموعات فرعية من MuSC. عند التحقيق في تأثير سيرنا محددة على MuSCs باستخدام طريقة ثقافة الألياف العضلية العائمة ينبغي إجراء مقارنة بين الشرط مع siRNA استهداف إلى التحكم غير استهداف داخل نفس الماوس والعضلات. ويوصى بذلك لتجنب الاختلافات الخاصة بالماوس والتي قد تغطي أو تضخم آثار سيرنا. يمكن تحديد كفاءة الضربة القاضية من خلال تحليلات immunofluorescence مع الأجسام المضادة الموجهة ضد الجين المستهدف باستخدام ألياف الميو فايبر المفردة مع MuSCs المجاورة لها. إذا لم يكن هذا خيارا ، يمكن للمرء اختبار كفاءة الضربة القاضية في الخلايا الميوبلاستية الأولية تليها تحليلات RT-PCR أو المناعة الكمية. وينبغي تحديد كفاءة سيرنا قبل تحليل تأثير سيرنا على MuSCs على ألياف الميوبر واحد. استخدام تجمع الذكية التي تتكون من 4 siRNAs مختلفة مقابل واحد يزيد من كفاءة الضربة القاضية ولكن أيضا يزيد من خطر استهداف غير محدد. وينبغي استخدام siRNA غير المستهدفة كعنصر تحكم. لمراقبة كفاءة العدوى مباشرة ، يمكن للمرء استخدام سيرنا غير المستهدفة الموسومة بالفلورسنت كما يتم تنفيذها هنا. النقطة الزمنية ل transfection مع سيرنا حوالي 4 ساعات بعد العزل، وهي نقطة زمنية عندما الصفيحة القاعدية المحيطة MuSCs نفاذية بالفعل لsiRNA. إذا كان ينبغي التحقيق في تأثير سيرنا محددة على MuSCs بعد 72 أو 96 ساعة، فمن المستحسن لإجراء ثانية سيرنا transfection بعد 24 ساعة أو 48 ساعة للحفاظ على كفاءة ضربة قاضية عالية.
يعرض المقايسة ثقافة الألياف العضلية مزايا متنوعة مقارنة بالتحقيق في MuSCs مع أساليب ثقافة الخلايا التقليدية. تبقى MuSCs مرتبطة بالألياف العضلية خلال عملية العزل بأكملها ، وبالتالي الحفاظ على التفاعل الحاسم ل MuSC مع مكانتها19و23و24و25. التفاعل المحفوظة من MuSCs مع الألياف العضلية هو شرط أساسي لدراسة الآثار المتخصصة تعتمد على وظائف MuSC، والتي لا يمكن تلخيصها في الثقافات التقليدية 2D ميوبلاست. على سبيل المثال، أثناء الشيخوخة MuSCs عرض ضعف قدرة الميوجيني مما أدى إلى انخفاض الكفاءة لتجديد الأنسجة العضلية بعد الضرر20،26. ويعزى هذا الانخفاض جزئيا على الأقل إلى التغيرات في مكانة MuSC ، ولا سيما التغيرات في تكوين ECM27،28. يسمح بروتوكول ثقافة الألياف العضلية بالدراسة والتدخل في هذه التغييرات المتخصصة الشاذة.
وعلى النقيض من الطريقة الموصوفة هنا، فإن تنقية المركبات المخاطية عن طريق تقنيات التصنيف المناعي والفرز مثل FACS (فرز الخلايا المنشطة الفلورية) أو MACS (فرز الخلايا المغناطيسية) تنطوي على إزالة أجهزة MuSCs من مكانتها. ومن المثير للاهتمام، والثقافات 2D من MuSCs معزولة من العضلات القديمة تفقد العظة extrinsic وتتصرف على غرار MuSCs معزولة عن العضلات الشابة وبالتالي لا تلخيص الوضع في الجسم الحي بشكل مناسب29. وعلاوة على ذلك، فإن التفكك الكامل للأنسجة العضلية ووضع العلامات على MuSCs مع علامات السطح يؤدي إلى تغييرات النسخ وتنشيط الخلايا30،31،32. ميزة أخرى لنظام ثقافة الألياف العضلية هي إمكانية التدخل في وظائف MuSC على مختلف المستويات. يمكن تحقيق التلاعب في MuSCs على الألياف العضلية المثقفة بشكل فعال من خلال ضربة قاضية جينية بوساطة siRNA كما هو موضح هنا بالتفصيل. وبالمثل ، فإن تطبيق المركبات الكيميائية أو تسليم البروتينات المؤتلفة فعال جدا للتدخل في مسارات الخلايا الجذعية20،28. وعلاوة على ذلك، تسمح ناقلات التعبير الرجعية أو العدسية بإدخال جينات خارجية المنشأ، أي المسوخ النشطة التأسيسية33. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استكشاف تأثير العوامل الخارجية على وظائف MuSC في النظام الموصوف هنا ، على سبيل المثال ، يمكن استكمال ظروف الثقافة ب supernatant من مصادر فسيولوجية أو مرضية مختلفة لنموذج حالات مختلفة مثل السرطان cachexia34،35.
أحد قيود الطريقة الموصوفة هنا هو حقيقة أن نظام ثقافة الألياف العضلية الوحيد لا يمكن أن يلخص تماما تأثير جميع العوامل النظامية أو تأثير أنواع الخلايا الأخرى على MuSCs. أيضا ، فإن الوقت الذي يمكن أن تبقى فيه الألياف العضلية قابلة للحياة في الثقافة محدودة ، وبالتالي تركز دراسة العمليات ذات الصلة ب MuSC على الأحداث المبكرة مثل التنشيط والالتزام العضلي. وعلاوة على ذلك، فإن التحقيق في تفاعل MuSC مع الخلايا المتخصصة الأخرى مثل الخلايا المناعية أو خلايا السلف الليفية الدهنية غير ممكن. للتحقيق في الآثار الجهازية على وظائف MuSC يمكن للمرء إما إجراء تجارب إصابة العضلات تليها تحليل تجديد العضلات في الجسم الحي أو إجراء تجارب زرع36،37.
ويوفر بروتوكول العزل والثقافة الميوفيبر معا فرصة عظيمة لإجراء دراسات جينية أو ميكانيكية على أجهزة ال موزك البالغة دون الحاجة إلى نماذج فأرة معدلة وراثيا ويمكن أن يقلل من التجارب على الحيوانات.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كريستين بوسير وكريستينا بيكر على المساعدة التقنية الممتازة والقراءة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل بمنحة من مؤسسة دويتشه فوردشونجسجيمينشافت إلى JvM (MA-3975/2-1) ومؤسسة كارل زايس ودويتشه كريبشيلفي (DKH-JvM-861005).
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
Riferimenti
- Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. Skeletal muscle aging – Stem cells in the spotlight. Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).
- Chang, N. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells: the architects of skeletal muscle. Current Topics in Developmental Biology. 107, 161-181 (2014).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysics and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (13), 2559-2570 (2019).
- Motohashi, N., Asakura, A. Muscle satellite cell heterogeneity and self-renewal. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2, 1 (2014).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and culture of individual myofibers and their adjacent muscle stem cells from aged and adult skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 2045, 25-36 (2019).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- Mourikis, P., et al. A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells. 30 (2), 243-252 (2012).
- Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. Journal of Cell Biology. 190 (3), 427-441 (2010).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Troy, A., et al. Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).
- Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127, 4543-4548 (2014).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Eliazer, S., et al. Wnt4 from the Niche Controls the Mechano-Properties and Quiescent State of Muscle Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 654-665 (2019).
- Goel, A. J., Rieder, M. K., Arnold, H. H., Radice, G. L., Krauss, R. S. Niche cadherins control the quiescence-to-activation transition in muscle stem cells. Cell Reports. 21 (8), 2236-2250 (2017).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular wisp1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12 (3), 333-344 (2013).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).
- Judson, R. N., et al. The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. Journal of Cell Science. 125, 6009-6019 (2012).
- He, W. A., et al. NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia. Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).
- Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J. Wnt7a counteracts cancer cachexia. Molecular Therapy Oncolytics. 16, 134-146 (2020).
- Feige, P., Rudnicki, M. A. Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle. Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).
- Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration. Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).
