このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。
成体骨格筋組織は、再生能力に欠かせない幹細胞集団を抱えている。筋肉の損傷時に、筋肉幹細胞は静止状態を離れ、筋肉幹細胞プールの補充と共に損傷した組織の修復につながる筋形成プログラムを活性化する。様々な因子が筋肉幹細胞活性に影響を及ぼし、その中でも固有の刺激だけでなく、直接筋幹細胞環境、幹細胞ニッチからのシグナルもある。関連する筋幹細胞を持つ単一の筋線維の単一の分離および培養は、幹細胞とニッチの相互作用のほとんどを維持し、したがって、筋肉幹細胞機能ex vivoを研究する最も近い可能性である。ここで、単離のためのプロトコル、培養、siRNAトランスフェクションおよびマウスEDL(伸長ジデンマス長指)筋からのそれぞれの筋線維上の筋幹細胞の免疫染色が提供される。ここで概説する実験条件により、生体内動物実験を必要とせずに筋原性活性の調査を含む筋幹細胞ex vivoの研究と操作が可能になります。
成体の骨格筋は、主に多核化筋繊維で構成された死後の組織であり、これは自発的な動きのためのエフェクター細胞である。それは、胚性筋形成に似て、年齢および疾患1の障害を受けるプロセスである再生する顕著な能力を有する。骨格筋のこの顕著な再生能力は、筋幹細胞(MuSC)に依存し、これはまた、サルコレンマと筋繊維の基底層層間の位置のために衛星細胞とも呼ばれています2,3.安静状態下では、MuSCは静止しており、Sprouty14、5、6、7、8などの転写因子Pax7および静止マーカーの発現によって特徴付けられる。活性化すると、例えば、傷害後、MuSCは静止状態を離れ、筋原性調節因子MyoD9をアップレギュレータする。Pax7/MyoD二重陽性のMuSCは増殖し、それにより筋形成前駆細胞を生成し、しばしば筋芽細胞とも呼ばれる。これらの筋芽細胞は、次にさらに細長い筋細胞に分化し、分子および形態学的変化と一致するプロセス、例えば、Pax7の喪失およびミオゲニン発現10のアップレギュレーションを行う。その後、筋細胞は最終的に互いに融合するか、または既存の筋繊維に融合し、損傷した組織を修復する。重要なことに、筋肉幹細胞のごく一部はMyoDのアップレギュレーションを元に戻し、自己更新することができます11.MuSC分化および筋原性進行の状態は、Pax7、MyoDおよびミオゲニン10などの筋形成マーカーの調査によって容易に観察することができる。
隣接するMuSCsを伴う単一のミオファイバーの文化は、MuSCが内因性のニッチ12、13に残っているので、ex vivo設定でMuSC機能を調査するための優れた方法である。MuSCの挙動は、固有の信号だけでなく、粘液およびミオファイバー自体を取り巻く細胞外マトリックス(ECM)の成分を含む特殊な解剖学的位置であるニッチによって提供される外因性信号によって調節される。たとえば、MuSC 静止の外因性レギュレータの 1 つがノッチシグナリングです。ここでは、信号キューは、ミオファイバとECM14、15、16の両方からMuSCによって受信されます。さらに、MuSCニッチは、MuSCの分裂軸を制御するために重要であり、このようにMuSCドーター細胞17、18の細胞運命を調節する。合理的に、非対称MuSC部門、筋原性の進行および自己再生のようなパラメータは、この実験的なセットアップで一意に評価することができる。例えば、多細胞クラスターは、72時間培養期間後に1つのMuSCから生じ、自己更新、増殖およびさらに分化されたMuSCs8、19、20、21などの異なる筋原集団の発生および割合について調べることができる。MuSCの分化状態は、Pax7、MyoDおよびミオゲニンの発現/共発現の調査によって決定することができる。72時間培養後、クラスター内の細胞は、以下のパラメータによって識別することができる:Pax7細胞のみが自己更新MuSCであり、Pax7/MyoD二重陽性細胞は増殖/活性化されたMuSCであり、さらに分化した筋細胞はミオゲニン陽性22である。さらに、MuSCの数または細胞周期/活性化への再突入は、例えば、上記のパラメータに基づく免疫蛍光ベースの分析を通じて、筋形成進行に加えて調べることができる。
ここで、ミオファイバー絶縁および培養プロトコルの固有の特徴、例えば、MuSCとそのニッチとの相互作用の保存について説明する。マウス全体のEDL(伸張ジジトーム長さ)筋肉は慎重に解剖され、コラゲターゼによって消化され、物理的に三分化され、関連するMuSCを伴う単一の筋線維を得てさらなる培養を行う。さらに、このプロトコルは、トランスジェニック動物を必要とせずに、候補遺伝子の機能分析や連続した免疫蛍光ベースの分析のために、SiRNAを用いてMuSCをトランスフェクトするステップを説明する。
ここでは、インビトロアプローチを用いてMuSCにおける特定の遺伝子の役割を機能的に調査する方法を紹介する。重要なことに、ここで説明するシステムでは、MuSCは、そのニッチとMuSCの相互作用のほとんどを維持する可能な限りインビボの状況に似た条件で培養されています。これは、浮遊条件下での隣接するMuSCsと連続したsiRNAトランスフェクションで単離されたミオファイバーを培養することによって達成される。免疫蛍光分析を通じて72時間培養中のMyofiber単離、siRNAトランスフェクションおよびMuSC集団の調査の手順について説明する。さらに、30時間培養後に、全MuSCの約74%が蛍光標識対照siRNAでトランスフェクションされたことが実証された。
特に注意深く伸び、つまむ、または圧迫が筋繊維の収縮および連続死につながるので、EDL筋肉の慎重な解剖に焦点を当てるべきです。さらに、各条件で反復ごとに少なくとも20種類のミオファイバーからMuSCのクラスタを調査することが重要です。MuSC の数とプロパティは MuSC のサブ集団の存在によって変化するため、これは必要です。フローティングミオファイバ培養法を用いてMuSCに対する特異的siRNAの効果を調べると、標的siRNAと非標的制御との条件の比較は、同一マウスおよび筋肉内で行われるべきである。これは、siRNAの影響をカバーまたは増幅する可能性のあるマウス固有の違いを避けるために推奨されます。ノックダウン効率は、隣接するMuSCを有する単一のミオファイバーを用いて、標的遺伝子に向けられた抗体による免疫蛍光分析によって決定することができる。これがオプションでない場合は、一次筋芽細胞のsiRNAノックダウン効率をテストし、続いて定量的RT-PCRまたはイムノブロット分析を行うことができます。siRNAの効率は、単一のミオファイバーに対するMuSCに対するsiRNAの影響を分析する前に決定する必要があります。4 つの異なる siRNA と 1 つの siRNA から成るスマート プールを使用すると、ノックダウン効率が向上しますが、非特異的ターゲティングのリスクも高まります。非標的siRNAはコントロールとして使用されるべきである。トランスフェクション効率を直接監視するために、ここで行う蛍光標識非標的siRNAを使用することができる。siRNAによるトランスフェクションのタイムポイントは、分離後約4時間で、MuSCを取り巻く基底層がsiRNAに対して既に透過性を有する時点である。72または96時間後のMuSCsに対する特異的siRNAの効果を調べる必要がある場合は、24時間後または48時間後に2回目のsiRNAトランスフェクションを行い、高いノックダウン効率を維持することをお勧めします。
ミオファイバー培養アッセイは、従来の細胞培養法によるMuSCの調査に比べ、多様な利点を示しています。MuSC は、全体の分離プロセス中にミオファイバーに取り付けられたままで、そのニッチ19、23、24、25と MuSC の重要な相互作用を維持します。MuSCとミオファイバーの保存された相互作用は、従来の2D筋芽細胞培養では再現できないMuSC機能に対するニッチ依存効果を研究するための前提条件である。例えば、加齢時にMuSCsは、損傷20、26の後に筋組織を再生する効率を低下させる結果として、筋原性能力の低下を示す。この障害は、少なくとも部分的には、MuSCニッチの変化、特にECM組成物27、28の変化に起因する。ミオファイバー培養プロトコルは、これらの異常なニッチ変化に対する研究と干渉を可能にする。
ここで説明する方法とは対照的に、FACS(蛍光活性化細胞分類)やMACS(磁気細胞分類)のような免疫標識およびソート技術によるMuSCの精製は、それらのニッチからMuSCを除去することを含む。興味深いことに、老化した筋肉から分離されたMuSCの2D培養は、その外因性の手掛かりを緩め、若い筋肉から分離されたMuSCと同様に振舞い、それによってインビボ状況を適切に29に再現しない。さらに、筋肉組織の完全解離および表面マーカーによるMuSCの標識は、細胞30、31、32の転写的変化および活性化をもたらす。ミオファイバー培養システムのもう一つの利点は、種々のレベルでMuSC機能を妨害する可能性である。培養されたミオファイバー上のMuSCの操作は、ここで詳細に説明するsiRNA媒介遺伝子のノックダウンによって効果的に達成することができる。同様に、化学化合物の適用または組換えタンパク質の送達は、幹細胞経路20,28を妨害するのに非常に有効である。さらに、レトロまたはレンチウイルス発現ベクターは外因性遺伝子の導入を可能にする、すなわち、構成的活性変異体33。さらに、MuSC機能に対する外因因子の影響は、ここで説明するシステムで探索することができ、例えば、培養条件は、癌のキャッシュシア34、35のような異なる状態をモデル化するために異なる生理学的または病理学的源からの上清を補うことができる。
ここで説明する方法の1つの制限は、単一のミオファイバー培養システムが、すべての全身的要因の影響または他の細胞タイプのMuSCsへの影響を完全に再現できないという事実である。また、ミオファイバーを培養で生存できる時間は限られているため、MuSC関連プロセスの研究は活性化や筋形成的コミットメントなどの初期の事象に焦点を当てています。さらに、免疫細胞や線維状異形成前駆細胞などの他のニッチ細胞とのMuSC相互作用の調査は不可能である。MuSC機能に対する全身的な影響を調べるには、筋肉損傷実験を行い、その後に生体内での筋再生の解析を行うか、移植実験を行う36,37。
一緒に考えて、ミオファイバー分離および培養プロトコルは、トランスジェニックマウスモデルの要件なしに成人MuSCに関する遺伝的または機械学的研究のための絶好の機会を提供し、潜在的に動物実験を減らすことができる。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、優れた技術支援と原稿の批判的な読書のためにクリスティン・ポーザーとクリスティーナ・ピッカーに感謝します。この作品は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフトからJvM(MA-3975/2-1)、カール・ツァイス財団、ドイツ・クレブシルフェ(DKH-JvM-861005)への助成金によって支えられました。
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
horse serum | Gibco | 26050-088 | |
Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |