体外荧光显微镜基于动感检测的肌素特异性适应

肌酸是运动蛋白，利用从腺苷三磷酸盐（ATP）水解¹中提取的能量对作用素丝施加力。肌素包含头部、颈部和尾部域。头部域包含作用素结合区域以及 ATP 结合和水解的站点。颈部域由智商图案组成，它们与光链、镇静素或镇静蛋白类蛋白质^2、3结合。尾部区域具有几种功能，特定于每类肌素，包括但不限于两个重链的变暗，货物分子的结合，并通过与头部域的自动抑制相互作用调节肌素^1。

肌素的多功能性因班级而异。其中一些属性包括值班比率（肌素的机械周期的一部分，肌素必然作用）和过程性（电机在分离前在其轨道上进行多个步骤的能力^）4。超过40类肌素是根据序列分析^{5，6，7，8}确定的。第2类肌素被归类为”常规”，因为它们是第一个被研究的：因此，所有其他类型的肌素被归类为”非常规”。

肌素 5a （M5a） 是 5 级肌素，是一种加工电机，这意味着它可以在分离前沿行动素采取多个步骤。它有一个高关税比率，表明它花了很大一部分机械周期必然行动^{9，10，11，12，13，14。}与其他肌酸一样，重链包含一个N-终端电机域，包括一个行动素结合和ATP水解站点，然后是一个颈部区域，作为一个杠杆臂，与六个智商图案，结合到基本的光链（ELC）和镇静剂^{（CAM）15。}尾部区域包含α-螺旋线圈，使分子变暗，然后是用于结合货物的球状尾部区域。其动力学反映了它参与黑色素细胞中的黑色素体的运输和Purkinje神经元^16，17的内质视网膜的运输。M5a 被认为是典型的货物运输电机¹⁸。

类 2 肌素， 或传统的肌素， 包括肌素， 骨骼， 心脏和光滑的肌肉的力量收缩除了非肌肉肌素 2 （NM2） 异形， NM2a， 2b， 和 2c^19.NM2同构体存在于所有细胞的细胞质中，在细胞因子、粘附、组织形态和细胞迁移19、20、21、22中具有共同作用。本文讨论了非肌肉肌素2b（NM2b）23背景下的常规肌素协议。NM2b，与M5a相比，具有较低的关税比率，并且酶速度较慢，V_最大值为0.2 s^-123，而M5a的V_最大值为≈18^s-124。值得注意的是，用两个头截断的NM2b构造不会轻易在行动上进行处理性移动：相反，每次遇到行动素会导致功率冲程，然后分离分子^25。

NM2b 包含两个肌素重链，每个链条都有一个球状头域、一个杠杆臂（带一个 ELC 和一个调节光链 （RLC））和一个α螺旋线圈杆/尾域，大约 1，100 个氨基酸长，使这两个重链变暗。NM2b的酶活性和结构状态受^RLC23磷酸化调节。未磷基NM2b，在ATP和生理离子强度（约150mM盐）的存在下，采用紧凑的构象，其中两个头参与不对称的相互作用，尾巴折回头部在两个地方^23。在这种状态下，肌素与作用素没有很强的相互作用，并且具有非常低的酶活性。在RLC磷酸化由镇静肌素依赖肌素光链激酶（MLCK）或Rho相关蛋白激酶，分子延伸和与其他肌素通过尾部区域，形成约30肌素分子²³的双极丝。上述RLC的磷化也导致NM2b的ACTPase活性增加约四倍^{26，27，28。}这种双极丝排列，每端都有许多肌素电机，在收缩和张力维护中的作用得到优化，其中具有对立极性的作用线可以相互移动^23，29。因此，NM2b 已被证明是与行为素交互时作为电机的合奏。这种灯丝中的大量电机使NM2b灯丝在作用丝上进行处理性移动，使体外细丝的处理性成为可能，以²⁹为特征。

虽然在理解肌素在细胞中的作用方面取得了进展，但有必要在蛋白质水平上了解其个体特征。为了理解在简单的蛋白质-蛋白质相互作用水平，而不是细胞内部的活性肌素相互作用，我们可以表达和净化重组肌素用于体外研究。这些研究的结果然后告诉机械生物学家关于特定肌素的生物物理性质，最终驱动复杂的细胞过程12，13，14，25，29。通常，这是通过添加亲和力标签到全长或截断肌素结构和净化通过亲和色谱^{29，30，31。}此外，该结构可以设计为包括基因编码的氟磷或合成荧光蛋白标签。通过添加这样的荧光标签，可以进行单分子成像研究来观察肌素力学和动力学。

经过净化，肌素可以通过几种方式进行特性。ATPase 活性可以通过色度测量方法进行测量，从而深入了解电机在^{不同条件下的整体}能耗和作用亲和力。为了了解其动力的机械化学性，需要进一步的实验。本文详细介绍了两种体外荧光显微镜方法，可用于描述纯化肌素蛋白的体外特性。

其中第一种方法是滑翔作用素丝测定，可用于定量研究肌素电机的合奏特性，以及定性地研究一批纯化蛋白³³的质量。虽然本文讨论了使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜进行此测定，但这些实验可以有效地使用配备数码相机的广域荧光显微镜进行，这在许多实验室中很^常见。在此检测中，肌素电机的饱和层连接到覆盖唇上。这可以使用硝基纤维素，抗体，膜，SiO₂衍生表面（如三甲基氯西兰），除其他29，33，35，36，37，38。荧光标记的活性丝通过覆盖唇室，在室室中，作用素与附着在表面的肌素结合。添加 ATP（和 NM2 研究中的激酶）后，对腔室进行成像，以观察表面肌素对作用素丝的转移。跟踪软件可用于关联每个滑翔行动丝的速度和长度。分析软件还可以提供移动和静止作用素丝的数量，这可用于确定给定肌素制备的质量。停滞的细丝的比例也可以故意调节通过表面系绳的Actin到其他蛋白质，并测量，以确定肌素³⁹的负荷依赖性。由于每个作用素灯丝可以由大量的可用电机推动，这种测定是非常可重复的，最终测量的速度是强大的扰动，如改变在开始肌素浓度或在解决方案中存在其他因素。这意味着它可以很容易地修改，以研究肌素活动在不同的条件下，如改变的磷化，温度，离子强度，溶液粘度，以及由表面系绳引起的负载的影响。虽然诸如不能进行ATP水解的强结合肌素”死头”等因素可导致作用素丝停滞，但存在多种方法来缓解此类问题并允许精确测量。肌素的动能特性因班级而异，根据所使用的具体肌素，此测定中的行为素丝滑翔速度可能从低于 20 nm/s（肌素 9）^40、41和高达 60，000 nm/s（Characean 肌素 11）^42。

第二次检测颠倒了滑翔行动素丝测定¹²的几何形状。在这里，作用细丝连接到覆盖唇表面，M5a单分子或NM2b单双极丝的运动被可视化。此检测可用于量化单肌素分子或丝在行动素上的运行长度和速度。盖唇涂有一种化合物，可阻断非特定结合，同时使表面功能化，如生物素聚乙烯乙二醇（生物素-PEG）。添加改良的维丁衍生物，然后使表面和生物素化作用素通过腔室，导致一层F-actin稳定地绑在腔室底部。最后，激活和荧光标记肌素（通常为 1-100 nM）流经腔室，然后成像以观察肌素在固定作用素丝上的运动。

这些模式代表快速和可重复的方法，可用于检查非肌肉和肌肉肌素的动态。本报告概述了净化M5a和NM2b的程序，分别代表非常规和常规肌素。随后，将讨论一些肌素特异性适应，这些适应可以执行，以在两种类型的检测中成功捕获运动。

表达和分子生物学
感兴趣的肌素的 cDNA 必须克隆到经过修改的 pFastBac1 矢量上，该载体在表示 M5a-HMM 时编码 C 端端旗标签 （DYKDDDDK），如果表示 NM2b^{23、43、44、45、46}的全长分子，则编码 N-终端标志。NM2b 上的 C 端旗标签导致 FLAG 亲和力列的蛋白质亲和力减弱。相比之下，N-终端标记的蛋白质通常与旗亲和力列²³结合得很好。N-终端标记蛋白保留酶活性、机械活性和磷酸依赖调节^23。

在本文中，使用了截断的鼠标 M5a 重质肌蛋白 （HMM） 样结构，在 FLAG 标签和肌素重链的 C 终点之间使用了 GFP。请注意，与 NM2b 不同，M5a-HMM 可以使用 N 或 C 端标志成功标记和纯化，在这两种情况下，产生的构造都将是活性。M5a 重链在氨基酸 1090 中被截断，在 GFP 和 M5a⁴⁷的线圈线圈区域之间含有三个氨基酸链 （GCG）。GFP 和 FLAG 标签之间没有添加其他链接器。M5a – hmm 与平静的杜林共同表达。全长人类NM2b结构与ELC和RLC共同表达。RLC 的 N-术语通过五种氨基酸 （SGLRS） 的链接器与 GFP 融合在一起。直接连接到标志标签的是一个光环塔格。在光环塔格和肌素重链的N终点之间，有一个由两种氨基酸（AS）制成的链接器。

两种肌素制剂均从一升感染巴库洛病毒的 Sf9 细胞培养中纯化，密度约为2×10⁶ 细胞/mL。每个子组的 baculo 病毒数量取决于由制造商说明确定的病毒的感染倍数。在M5a病例中，细胞与两种不同的巴库洛病毒共同感染，一种用于镇静剂，另一种用于M5a重链。在NM2b病例中，细胞与三种不同的病毒共同感染，一种用于ELC，一种用于RLC，另一种用于NM2b重链。对于使用多种肌素（或其他多复合蛋白）的实验室，这种方法是有效的，因为它允许重链和轻链的许多组合，常用的轻链，如镇静剂，可以与许多不同的肌素重链共同感染。所有细胞工作都是在生物安全柜中完成的，采用适当的无菌技术，以避免污染。

对于 M5a 和 NM2b 的表达，通过离心机在感染后 2-3 天收集产生重组肌素的 Sf9 细胞，并存储在 -80 °C 下。 细胞颗粒是通过在4°C下离心共感染的Sf9细胞，在2，800 x g下30分钟获得的。蛋白质净化过程详见下文。