체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

묘신은 아데노신 삼위산염(ATP) 가수분해^1에서유래한 에너지를 이용하여 액틴 필라멘트에 힘을 발휘하는 모터 단백질이다. 미신에는 머리, 목 및 꼬리 도메인이 포함되어 있습니다. 헤드 도메인에는 액틴 결합 영역뿐만 아니라 ATP 바인딩 및 가수 분해 사이트가 포함되어 있습니다. 목 도메인은 광 사슬, 칼모둘린 또는 칼모둘린과 같은 단백질^2,3에결합하는 IQ 모티브로 구성됩니다. 상기 tail 영역은 두 개의 무거운 사슬의 이압, 화물 분자의 결합, 헤드 도메인과의 자동 억제 작용을 통한 미신의 조절을 포함하되 이에 국한되지 않는 미오신의 각 클래스에 특정한 여러 기능을^갖는다.

미오신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다릅니다. 이러한 특성 중 일부는 듀티 비율(myosin이 액틴에 바인딩되는 myosin의 기계적 사이클의 일부)과 처리성(분리 전에 트랙에서 여러 단계를 하는 모터의 능력)을 포함한다.^4. 미신의 40개 이상의 클래스는 서열 분석^5,6,7,8에기초하여 결정되었다. 2급 묘신은 가장 먼저 연구되었기 때문에 “종래”로 분류됩니다. 따라서 다른 모든 묘신 은 “틀에 얽매이지 않는” 것으로 분류됩니다.

미신 5a (M5a)는 클래스 5 묘신이며, 해리하기 전에 액틴을 따라 여러 단계를 취할 수 있음을 의미 가공 모터입니다. 그것은 높은 관세 비율을가지고, 그것은 액틴^{9,10,11,12,13,14에}바인딩 되는 기계적 사이클의 큰 부분을 보낸다는 것을 나타내는. 다른 묘신과 공통적으로, 헤비 체인은 액틴 결합 및 ATP 가수분해 부위를 모두 포함하는 N 단말 모터 도메인을 포함하고 있으며, 레버 암 역할을 하는 넥 영역이 있으며, 에센셜 라이트 체인(ELC)과 칼모둘린(CaM)^15에결합하는 6개의 IQ 모티브가 있습니다. 꼬리 영역에는 분자를 분화하는 α-헬리칼 코일, 결합화물을 위한 구형 꼬리 영역이 포함됩니다. 그것의 운동은 멜라노세포와 Purkinje^{뉴런16,17의}폐래 망상에 있는 멜라노좀의 수송에 그것의 관여를 반영합니다. M5a는 프로토 타입화물 운송 모터^(18)로간주됩니다.

클래스 2 묘신, 또는 종래의 묘신은, 비근육 myosin 2 (NM2) 등방형, NM2a, 2b 및 2c¹⁹이외에 골격, 심장 및 부드러운 근육의 수축을 전력하는 myosins를 포함한다. NM2 동위원소는 모든 세포의 세포질에서 발견되며 사이토카네시스, 접착, 조직 형태 발생 및 세포 이동^{19,20,21,22에서}공유된 역할을 갖는다. 본 논문은 비근육 미오신 2b(NM2b)^23의맥락에서 종래의 묘신 프로토콜에 대해 설명한다. NM2b는 M5a에 비해 낮은 관세율을 가지며 M5a의 V_최대 치인 ≈18^s-124에비해 V_최대 0.2 s^{-1 -123으로} 효소적으로 느립니다. 특히 두 개의 헤드가 있는 잘린 NM2b 구문은 actin에서 쉽게 처리하지 않습니다. 오히려, 액틴과의 각 만남은^{분자(25)의}해리에 이어 파워 스트로크를 초래한다.

NM2b에는 두 개의 미신 중형 체인이 포함되어 있으며, 각 체인은 1개의 구형 헤드 도메인, 1개의 레버 암(1개의 ELC 및 하나의 규제 라이트 체인(RLC)을 포함하며, α 백리향 코일 로드/꼬리 도메인, 약 1,100개의 아미노산이 이 두 개의 무거운 사슬을 이산화합니다. NM2b의 효소 활성 및 구조 상태는 RLC^23의인산화에 의해 조절된다. ATP 및 생리이온 강점(약 150mMM염)이 있는 NM2b는 두 머리가 비대칭 상호 작용에 참여하고 꼬리가^23개소에서 머리 위로 다시 접는 컴팩트한 변형을 채택한다. 이 상태에서, 미신은 actin과 강하게 상호 작용하지 않으며 매우 낮은 효소 활동을 가지고 있습니다. 칼모둘린의존성 미오신 광사슬 키나아제(MLCK) 또는 로-관련 단백질 키나아제에 의한 RLC 인산화시, 분자는 꼬리 부위를 통해 다른 미오신과 연결하여 약 30개의 근신^{분자(23)의}양극성 필라멘트를 형성한다. 앞서 언급한 RLC의 인산화는 또한 NM2b의 액틴 활성화 ATPase 활성을 약 4배^26,27,28로증가시키는 것으로 이어진다. 양극성 필라멘트 배열은 양쪽 끝에 많은 미오신 모터를 특징으로하며, 수축 및 장력 유지 보수의 역할에 최적화되어 있으며, 반대극성을 가진 액틴 필라멘트는 서로 비교하여 움직일 수 있습니다^23,29. 이에 따라 NM2b는 액틴과 상호작용할 때 모터의 앙상블 역할을 하는 것으로 나타났다. 이 필라멘트 내의 많은 수의 모터를 통해 NM2b 필라멘트가 액틴 필라멘트에서 공정하게 움직일 수 있으므로^29개의특징을 나타내는 시험관 내 필라멘트 공정성을 가능하게 합니다.

세포에서 미신의 역할을 이해하는 과정에서 진전이 있었지만, 단백질 수준에서 그들의 개별적인 특성을 이해할 필요가 있다. 간단한 단백질 단백질 상호 작용 수준에서 actomyosin 상호 작용을 이해 하려면, 세포의 내부 보다는, 우리는 표현 하 고 체 외 연구에 사용 하기 위해 재조합 myosins를 정화할 수 있습니다. 그러한 연구의 결과는 궁극적으로 복잡한 세포 과정을 구동 특정 myosins의 생물학적 특성에 대해 mechano생물학자에게^{12,13,14,25,29를}알려줍니다. 전형적으로, 이것은 전체 길이 또는 잘린 미오신 구조에 친화성 태그를 추가하고 친화성 크로마토그래피(29,^30,31)를통해 정화함으로써 달성된다. 추가적으로, 생성은 합성 불소호로 단백질 라벨링을 위한 유전으로 응응가능한 형광또는 태그를 포함하도록 설계될 수 있다. 이러한 형광 라벨을 추가함으로써, 단일 분자 이미징 연구는 myosin 역학 및 운동학을 관찰하기 위하여 수행될 수 있습니다.

정제 후, 미신은 여러 가지 방법으로 특징지어질 수 있다. ATPase 활동은 색법 방법으로 측정할 수 있으며, 상이한 조건 하에서 모터의 전반적인 에너지 소비 및 액틴 친화성에 대한 통찰력을^{제공한다(32).} 그것의 운동성의 mechanochemistry에 관하여 배우기 위하여는, 추가 실험이 필요합니다. 이 논문은 정제된 myosin 단백질의 운동특성을 특성화하는 데 사용할 수 있는 두 가지 체외 형광 현미경-현미경 기반 방법을 자세히 설명합니다.

이러한 방법의 첫 번째는 미오신 모터의 앙상블 특성을 정량적으로 연구하고 정제 된 단백질^(33)의배치의 품질을 질적으로 연구하는 데 사용할 수있는 글라이딩 액틴 필라멘트 분석입니다. 이 논문은 이 분석법에 대한 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경의 사용에 대해 논의하지만, 이러한 실험은 많은 실험실^34에서흔하게 발견되는 디지털 카메라를 탑재한 광야 형광 현미경을 사용하여 효과적으로 수행될 수 있다. 이 분석에서, 미오신 모터의 포화 층은 커버 슬립에 부착된다. 이는 니트로셀룰로오스, 항체, 막, SiO 2-유도표면(예: 트리메틸클로로실레인)을 이용하여 달성될 수^있으며,그 중 에서도^{29,33,35,36,37, 38을}이용하여 달성할 수 있다. 형광으로 표지된 액틴 필라멘트는 커버슬립 챔버를 통과하며, 이 챔버는 표면에 부착된 미오신에 결합한다. ATP (및 NM2 의 연구에서 키나아제)를 추가하면 챔버는 표면에 묶인 myosins에 의한 액틴 필라멘트의 전좌를 관찰하도록 이미지화됩니다. 추적 소프트웨어를 사용하여 각 글라이딩 액틴 필라멘트의 속도와 길이를 상호 연관시킬 수 있습니다. 분석 소프트웨어는 또한 주어진 미오신 제제의 품질을 결정하는 데 유용 할 수있는 이동 및 고정 액틴 필라멘트의 수를 측정 할 수 있습니다. 정체된 필라멘트의 비율은 또한 의도적으로 다른 단백질에 actin의 표면 테더링에 의해 변조될 수 있고^{근신(39)의}부하 의존성을 결정하기 위하여 측정될 수 있다. 각 액틴 필라멘트는 다수의 사용 가능한 모터에 의해 추진될 수 있기 때문에, 이 분석법은 매우 재현가능하며, 최종 측정 속도는 시작 묘신 농도의 변경 또는 솔루션에 추가 인자의 존재와 같은 변투로 견고하다. 이는 변성, 온도, 이온 강도, 용액 점도 및 표면 테더에 의해 유도되는 부하의 효과와 같은 상이한 조건하에서 근신 활성을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다는 것을 의미한다. ATP 가수분해가 불가능한 강한 결합미오신 “죽은 머리”와 같은 요인이 지연된 액틴 필라멘트를 유발할 수 있지만, 이러한 문제를 완화하고 정확한 측정을 허용하는 여러 가지 방법이 존재합니다. 미신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다르며, 사용되는 특정 묘신에 따라 이 분석에서 액틴 필라멘트의 글라이딩 속도는 20nm/s(미신 9)^40,41,최대 60,000nm/s(샤라산 미신 11)⁴²미만에서 다를 수 있다.

두 번째 분석법은 글라이딩 액틴 필라멘트^분석12의형상을 반전시다. 여기서, 액틴 필라멘트는 표지슬립 표면에 부착되어 M5a 또는 NM2b의 개별 양극성 필라멘트의 단일 분자의 움직임이 시각화된다. 이 분석법은 액틴에 대한 단일 미오신 분자 또는 필라멘트의 실행 길이 및 속도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 커버슬립은 비특이적 결합을 차단하고 비오틴 폴리에틸렌 글리콜(biotin-PEG)과 같은 표면을 동시에 기능화하는 화학 화합물로 코팅됩니다. 수정된 아비딘 유도체의 첨가는 표면을 프라이밍하고 생체개화 액틴이 챔버를 통과하여 챔버의 바닥에 안정적으로 결합된 F-actin층을 초래한다. 마지막으로, 활성 및 형광표 미오신(전형적으로 1-100 nM)은 챔버를 통해 흐르고, 그 후 고정액소필라멘트를 통해 미오신 움직임을 관찰하도록 이미지화된다.

이 양식은 비근육과 근육 myosins 둘 다의 역학을 검토하기 위하여 이용될 수 있는 빠르고 재현가능한 방법을 나타냅니다. 이 보고서는 M5a와 NM2b를 각각 정화하고 특성화하는 절차를 각각 설명합니다. 다음은 두 가지 유형의 분석에서 모션을 성공적으로 캡처하기 위해 수행 될 수있는 일부 myosin 특정 적응에 대한 논의에 선행됩니다.

발현 및 분자 생물학
관심있는 myosin에 대한 cDNA는 M5a-HMM을 표현하는 경우 C 단말플래그 태그 (DYKDDDDK) 또는 N-단말 플래그 태그NM23,^{43,44, 44,45, 46, 46의}전체 길이 분자를 표현하는 경우 인코딩 수정 된 pFastBac1 벡터에 복제되어야합니다. NM2b의 C-단말 플래그 태그는 플래그 친화성 컬럼에 대한 단백질의 선호도가 약화됩니다. 대조적으로, N 단자 플래그 태그 단백질은 일반적으로 FLAG 선호도^열(23)에잘 결합한다. N-말단 태그 단백질은 효소 활성, 기계적 활성 및 인산화 의존성^{조절(23)을}유지한다.

이 논문에서는, 마우스 M5a 무거운 메로미신 (HMM)와 같은 구조가 플래그 태그와 myosin 무거운 사슬의 C-종점 사이에 GFP와 같은 구조를 사용하였다. NM2b와 달리 M5a-HMM은 N 또는 C 단말 FLAG 태그로 태그를 성공적으로 지정하고 정제할 수 있으며 두 경우 모두 결과 구성이 활성화됩니다. M5a 헤비 체인은 아미노산 1090에서 잘렸으며 GFP와 M5a^47의코일 코일 영역 사이의 3개의 아미노산 링커(GCG)를 함유하고 있다. GFP와 플래그 태그 사이에 추가 링커가 추가되지 않았습니다. M5a-HMM은 칼모둘린과 공동 표현되었다. 전신 인간 NM2b 구조는 ELC 및 RLC와 공동 표현되었다. RLC의 N-termini는 5개의 아미노산 (SGLRS)의 링커를 통해 GFP와 융합되었다. 플래그 태그에 직접 부착된 것은 할로태그였습니다. HaloTag와 미신 헤비 체인의 N-종자 사이에는 두 개의 아미노산 (AS)으로 만든 링커가 있었습니다.

두 myosin 제제는 약 2 x 10⁶ 세포/mL의 밀도로 바쿨로바이러스에 감염된 Sf9 세포 배양의 1리터로부터 정제되었다. 각 하위 단위에 대한 baculovirus의 볼륨은 제조업체의 지침에 의해 결정된 바이러스의 감염의 복합성에 의존합니다. M5a의 경우, 세포는 칼모둘린을 위한 2개의 다른 바쿨로바이러스-1, M5a 무거운 사슬을 위해 1개로 공동 감염되었다. NM2b의 경우, 세포는 ELC에 대한 3개의 다른 바이러스-1, RLC용, NM2b 중형 체인에 대해 하나씩 공동 감염되었다. myosins의 다양성으로 작업 하는 실험실에 대 한 (또는 다른 다 복합 단백질), 이 방법은 무거운 빛 사슬의 많은 조합을 허용 하 고 칼모둘린 등 일반적으로 사용 되는 라이트 체인 많은 다른 myosin 무거운 사슬과 공동 변환될 수 있기 때문에 이 접근 은 효율적입니다. 모든 세포 작업은 오염을 피하기 위해 적절한 멸균 기술을 가진 생물 안전 캐비닛에서 완료되었습니다.

M5a와 NM2b의 발현을 위해, 재조합 묘신을 생산하는 Sf9 세포는 원심분리를 통해 2-3일 후 감염 후, 원심분리를 통해 수집하고-80°C에 저장하였다. 세포 펠릿은 2,800 x g에서 30 분 동안 4 °C에서 공동 감염된 Sf9 세포를 원심분리하여 수득하였다. 단백질 정제 과정은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.