Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Myosines zijn motoreiwitten die kracht uitoefenen op actinefilamenten met behulp van de energie die wordt afgeleid van adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyse¹. Myosines bevatten een hoofd-, nek- en staartdomein. Het hoofddomein bevat het actinebindende gebied en de site van ATP-binding en hydrolyse. De nekdomeinen zijn samengesteld uit IQ-motieven, die zich binden aan lichte ketens, calmodulin of calmodulin-achtige eiwitten^2,3. Het staartgebied heeft verschillende functies die specifiek zijn voor elke klasse myosines, waaronder maar niet beperkt tot de verkleining van twee zware ketens, binding van ladingmoleculen en regulering van het myosine via auto-inhibitory interacties met de hoofddomeinen¹.

De beweeglijke eigenschappen van myosine variëren sterk tussen klassen. Sommige van deze eigenschappen omvatten de duty ratio (de fractie van de mechanische cyclus van myosine waarin de myosine gebonden is aan actine) en processiviteit (het vermogen van een motor om meerdere stappen op zijn spoor te maken voordat hij wordt losgemaakt)⁴. De meer dan 40 klassen myosines werden bepaald op basis van sequentieanalyses^5,6,7,8. De klasse 2 myosines zijn geclassificeerd als “conventioneel” omdat ze de eerste waren die werden bestudeerd; alle andere klassen myosines worden daarom geclassificeerd als “onconventioneel”.

Myosine 5a (M5a) is een klasse 5 myosine en is een processieve motor, wat betekent dat het meerdere stappen langs actine kan nemen voordat het dissocieert. Het heeft een hoge duty ratio , wat aangeeft dat het een groot deel van zijn mechanische cyclus besteedt aan actin^{9,10,11,12,13,14}. Net als andere myosines bevat de zware ketting een N-terminal motordomein dat zowel een actinebinding als een ATP-hydrolyseplaats omvat, gevolgd door een nekgebied dat dient als hefboomarm, met zes IQ-motieven die zich binden aan essentiële lichtketens (ELC) en calmodulin (CaM)¹⁵. Het staartgebied bevat α-spiraalvormige coiled-coils, die het molecuul dimmen, gevolgd door een bolvormig staartgebied voor het binden van lading. De kinetiek weerspiegelt zijn betrokkenheid bij het transport van melanosomen in melanocyten en van het endoplasmatisch reticulum in Purkinje neuronen^16,17. M5a wordt beschouwd als de prototypische vrachtvervoermotor¹⁸.

Klasse 2 myosines, of de conventionele myosines, omvatten de myosines die samentrekking van skelet, hart en gladde spieren aandrijven naast de niet-muscle myosine 2 (NM2) isovormen, NM2a, 2b en 2c¹⁹. De NM2-isovormen worden aangetroffen in het cytoplasma van alle cellen en hebben gedeelde rollen in cytokinese, adhesie, weefselmorfogenese en celmigratie^19,20,21,22. Dit artikel bespreekt conventionele myosineprotocollen in de context van niet-muscle myosine 2b (NM2b)²³. NM2b heeft, in vergelijking met M5a, een lage duty ratio en is enzymatisch langzamer met een V_max van 0,2 s^-123 in vergelijking met M5a’s V_max van ≈18 s^-124. Met name afgeknotte NM2b-constructies met twee koppen bewegen niet gemakkelijk procesief op actine; in plaats daarvan resulteert elke ontmoeting met actine in een machtsslag gevolgd door dissociatie van het molecuul²⁵.

NM2b bevat twee myosine zware kettingen, elk met één bolvormig hoofddomein, één hendelarm (met één ELC en één regulerende lichte ketting (RLC)), en een α-spiraalvormige spiraalvormige staaf/staartdomein, ongeveer 1.100 aminozuren lang, dat deze twee zware kettingen verkleint. De enzymatische activiteit en de structurele toestand van NM2b worden gereguleerd door fosforylering van RLC²³. Niet-gefosforyleerde NM2b, in aanwezigheid van ATP en fysiologische ionische sterktes (ongeveer 150 mM zout), keurt een compacte conformatie goed waarbij de twee koppen deelnemen aan een asymmetrische interactie en de staart op twee plaatsen terugvouwt over de koppen²³. In deze toestand heeft het myosine geen sterke interactie met actine en heeft het een zeer lage enzymatische activiteit. Bij RLC-fosforylering door calmodulin-afhankelijke myosine lichtketenkinase (MLCK) of Rho-geassocieerd eiwitkinase, breidt het molecuul zich uit en associeert het met andere myosines door het staartgebied om bipolaire filamenten te vormen van ongeveer 30 myosinemoleculen²³. De bovengenoemde fosforylering van de RLC leidt ook tot een verhoogde actine-geactiveerde ATPase-activiteit van NM2b met ongeveer vier keer^26,27,28. Deze bipolaire filamentopstelling, met veel myosinemotoren aan elk uiteinde, is geoptimaliseerd voor rollen in contractie- en spanningsonderhoud, waarbij actinefilamenten met tegengestelde polariteiten ten opzichte van elkaar kunnen worden verplaatst^23,29. Het is dan ook aangetoond dat NM2b als een ensemble van motoren fungeert bij interactie met actine. Het grote aantal motoren binnen deze gloeidraad laat NM2b-filamenten in staat om processief te bewegen op actinefilamenten, waardoor in vitro filamentprocesiviteit mogelijk is om²⁹te karakteriseren .

Hoewel er vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van de rol van myosines in de cel, is er een behoefte om hun individuele kenmerken op eiwitniveau te begrijpen. Om actomyosine-interacties op een eenvoudig eiwit-eiwitinteractieniveau te begrijpen, in plaats van in een cel, kunnen we recombinante myosines uitdrukken en zuiveren voor gebruik in in vitro studies. De resultaten van dergelijke studies informeren mechanobiologen vervolgens over de biofysische eigenschappen van specifieke myosines die uiteindelijk complexe cellulaire processen aansturen^{12,13,14,25,29}. Meestal wordt dit bereikt door een affiniteitstag toe te voegen aan een volledige of afgeknotte myosineconstructie en te zuiveren via affiniteitschromatografie^29,30,31. Bovendien kan de constructie worden ontworpen om een genetisch encodable fluorofoor of een label voor eiwitetikettering met een synthetische fluorofoor op te nemen. Door zo’n fluorescerend label toe te voegen, kunnen beeldvormingsstudies met één molecuul worden uitgevoerd om myosinemechanica en kinetiek te observeren.

Na zuivering kan de myosine op verschillende manieren worden gekarakteriseerd. ATPase-activiteit kan worden gemeten met colorimetrische methoden, die inzicht geven in het totale energieverbruik en de affiniteit van de motor onder verschillende omstandigheden in werking stellen³². Om meer te weten te komen over de mechanochemie van de beweeglijkheid ervan, zijn verdere experimenten nodig. Dit artikel beschrijft twee in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methoden die kunnen worden gebruikt om de beweeglijke eigenschappen van een gezuiverd myosine-eiwit te karakteriseren.

De eerste van deze methoden is de glijdende actinegloeidraadtest, die kan worden gebruikt om de ensemble-eigenschappen van myosinemotoren kwantitatief te bestuderen, evenals de kwaliteit van een partij gezuiverd eiwit kwalitatief te bestuderen³³. Hoewel dit artikel het gebruik van tirf-microscopie (Total Internal Reflection Fluorescence) voor deze test bespreekt, kunnen deze experimenten effectief worden uitgevoerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop in het breed veld die is uitgerust met een digitale camera, die vaak in veel laboratoria wordt aangetroffen³⁴. In deze test wordt een verzadigende laag myosinemotoren bevestigd aan een coverslip. Dit kan worden bereikt met behulp van nitrocellulose, antilichamen, membranen, SiO₂-gederivatiseerde oppervlakken (zoals trimethylchlorosilane), onder andere^{29,33,35,36,37,38}. Fluorescerend gelabelde actinefilamenten worden door de afdeklipkamer gepasseerd, waarop de actine zich bindt aan de myosine die aan het oppervlak is bevestigd. Na toevoeging van ATP (en kinases in de studie van NM2) wordt de kamer afgebeeld om de translocatie van actinefilamenten door de oppervlaktegebonden myosines te observeren. Tracking software kan worden gebruikt om de snelheid en lengte van elke glijdende actine filament correleren. Analysesoftware kan ook een maat bieden voor het aantal bewegende en stationaire actinefilamenten, wat nuttig kan zijn om de kwaliteit van een bepaald myosinepreparaat te bepalen. Het aandeel vastgelopen filamenten kan ook opzettelijk worden gemoduleerd door oppervlaktegebonden actine aan andere eiwitten en gemeten om de belastingsafhankelijkheid van het myosine³⁹te bepalen . Omdat elk actinefilament kan worden aangedreven door een groot aantal beschikbare motoren, is deze test zeer reproduceerbaar, waarbij de uiteindelijke gemeten snelheid robuust is voor verstoringen zoals veranderingen in de start myosineconcentratie of de aanwezigheid van extra factoren in de oplossing. Dit betekent dat het gemakkelijk kan worden aangepast om myosine-activiteit te bestuderen onder verschillende omstandigheden, zoals gewijzigde fosforylering, temperatuur, ionische sterkte, viscositeit van de oplossing en de effecten van belasting veroorzaakt door oppervlaktetethers. Hoewel factoren zoals sterk bindende myosine “dode hoofden” die niet in staat zijn tot ATP-hydrolyse vastgelopen actinefilamenten kunnen veroorzaken, bestaan er meerdere methoden om dergelijke problemen te verminderen en nauwkeurige metingen mogelijk te maken. De kinetische eigenschappen van myosine variëren sterk tussen de klassen en, afhankelijk van de specifieke myosine die wordt gebruikt, kan de snelheid van actinefilament glijden in deze test variëren van minder dan 20 nm/s (myosine 9)^40,41en tot 60.000 nm/s(Characean myosine 11)⁴².

De tweede test keert de geometrie van de glijdende actinegloeidraadtest^{om 12}. Hier worden de actinefilamenten aan het afdeklipoppervlak bevestigd en wordt de beweging van enkele moleculen van M5a of van individuele bipolaire filamenten van NM2b gevisualiseerd. Deze test kan worden gebruikt om de looplengtes en snelheden van enkele myosinemoleculen of filamenten op actine te kwantificeren. Een coverlip is bedekt met een chemische verbinding die niet-specifieke binding blokkeert en tegelijkertijd het oppervlak functionaliseert, zoals biotine-polyethyleenglycol (biotine-PEG). De toevoeging van gemodificeerde avidinderivaten priemt vervolgens het oppervlak en biotinylated actine wordt door de kamer gepasseerd, wat resulteert in een laag F-actine die stabiel aan de onderkant van de kamer is gebonden. Ten slotte wordt geactiveerd en fluorescerend gelabeld myosine (meestal 1-100 nM) door de kamer gestroomd, die vervolgens wordt afgebeeld om myosinebeweging over de stationaire actinefilamenten te observeren.

Deze modaliteiten vertegenwoordigen snelle en reproduceerbare methoden die kunnen worden gebruikt om de dynamiek van zowel niet-amuskel- als spier myosines te onderzoeken. Dit verslag schetst de procedures om zowel M5a als NM2b te zuiveren en te karakteriseren, die respectievelijk onconventionele en conventionele myosines vertegenwoordigen. Dit wordt gevolgd door een bespreking van enkele myosine-specifieke aanpassingen, die kunnen worden uitgevoerd om een succesvolle vastlegging van beweging in de twee soorten van de test te bereiken.

Expressie en moleculaire biologie
Het cDNA voor het myosine van belang moet worden gekloond op een gemodificeerde pFastBac1-vector die codeert voor een C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK) als M5a-HMM wordt uitdrukt, of een N-terminal FLAG-tag als het molecuul van NM2b^{23,43,44,45,46}wordt uitdrukt . C-terminal FLAG-tags op NM2b resulteert in een verzwakte affiniteit van het eiwit voor de KOLOM FLAG-affiniteit. Daarentegen bindt het N-terminaal MET VLAG gelabelde eiwit zich meestal goed aan de KOLOM FLAG-affiniteit²³. Het N-terminaal gelabelde eiwit behoudt enzymatische activiteit, mechanische activiteit en fosforyleringsafhankelijke regulatie²³.

In dit artikel werd een afgeknotte muis M5a heavy meromyosine (HMM)-achtige constructie gebruikt met een GFP tussen de FLAG-tag en het C-terminus van de myosine zware ketting. Merk op dat in tegenstelling tot NM2b M5a-HMM met succes kan worden getagd en gezuiverd met N- of C-terminal FLAG-tags en in beide gevallen zal de resulterende constructie actief zijn. De M5a zware keten werd afgekapt op aminozuur 1090 en bevat een drie aminozuur linker (GCG) tussen de GFP en het coiled-coil gebied van de M5a⁴⁷. Er is geen extra linker toegevoegd tussen de GFP en FLAG-tag. M5a-HMM werd samen met calmodulin uitgedrukt. De volledige menselijke NM2b-constructie werd samen met ELC en RLC tot uitdrukking gebracht. De N-termini van de RLC werd gefuseerd met een GFP via een linker van vijf aminozuren (SGLRS). Direct gekoppeld aan de FLAG-tag was een HaloTag. Tussen de HaloTag en het N-eindpunt van de myosine zware keten was een linker gemaakt van twee aminozuren (AS).

Beide myosinepreparaten werden gezuiverd uit één liter Sf9-celkweek die besmet was met baculovirus met een dichtheid van ongeveer 2 x 10⁶ cellen/ml. De volumes van het baculovirus voor elke subeenheid waren afhankelijk van de veelheid van infectie van het virus, zoals bepaald door de instructies van de fabrikant. In het geval van M5a werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met twee verschillende baculovirussen- één voor calmodulin en één voor M5a zware keten. In het geval van de NM2b werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met drie verschillende virussen- één voor ELC, één voor RLC en één voor NM2b zware keten. Voor laboratoria die werken met een diversiteit aan myosines (of andere multicomplexe eiwitten), is deze aanpak efficiënt omdat het veel combinaties van zware en lichte ketens mogelijk maakt en veelgebruikte lichte ketens zoals calmodulin kunnen worden gecotransfecteerd met veel verschillende myosine zware ketens. Al het celwerk werd voltooid in een bioveiligheidskast met de juiste steriele techniek om besmetting te voorkomen.

Voor de expressie van zowel M5a als NM2b werden de Sf9-cellen die de recombinante myosines produceren 2-3 dagen na infectie verzameld, via centrifugeren, en opgeslagen bij -80 °C. Celkorrels werden verkregen door de met co-geïnfecteerde Sf9-cellen gedurende 30 minuten bij 2.800 x g bij 4 °C te centrifugeren. Het eiwitzuiveringsproces wordt hieronder beschreven.