Summary

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Published: May 15, 2020
doi:

Summary

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Abstract

Descrevemos o procedimento passo-a-passo para cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias do camundongo em linhagens neuronais, seguido por uma série de ensaios para caracterizar as células diferenciadas. As células-tronco embrionárias do rato E14 foram usadas para formar corpos embrionários através do método de queda suspensa, e então induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais por ácido retinóico, e finalmente diferenciadas em neurônios. A reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e os experimentos de imunofluorescência revelaram que os progenitores e neurônios neurais exibem marcadores correspondentes (nestin para progenitores neurais e neurofilamento para neurônios) nos dias 8 e 12 pós-diferenciação, respectivamente. Experimentos de citometria de fluxo em uma linha E14 expressando um repórter gfp orientado pelo promotor Sox1 mostraram que cerca de 60% das células no dia 8 são GFP positivas, indicando a diferenciação bem sucedida das células progenitoras neurais nesta fase. Finalmente, a análise do RNA-seq foi utilizada para traçar o perfil das alterações transcriômicas globais. Esses métodos são úteis para analisar o envolvimento de genes e caminhos específicos na regulação da transição da identidade celular durante a diferenciação neuronal.

Introduction

Desde sua primeira derivação da massa celular interna dos blastocistos do camundongo em desenvolvimento1,2, as células-tronco embrionárias do rato (mESC) têm sido usadas como ferramentas poderosas para estudar a autoconexão e diferenciação das células-tronco3. Além disso, estudar a diferenciação do MEESC leva a uma tremenda compreensão dos mecanismos moleculares que podem melhorar a eficiência e a segurança na terapia baseada em células-tronco no tratamento de doenças como distúrbios neurodegenerativos4. Em comparação com os modelos animais, este sistema in vitro oferece muitas vantagens, incluindo simplicidade na prática e avaliação, baixo custo na manutenção de linhas celulares em contraste com os animais e relativa facilidade em manipulações genéticas. No entanto, a eficiência e a qualidade dos tipos de células diferenciadas são frequentemente afetadas por diferentes linhas de mESCs, bem como pelos métodos de diferenciação5,6. Além disso, os ensaios tradicionais para avaliar a eficiência de diferenciação dependem do exame qualitativo de genes marcadores selecionados que carecem de robustez e, portanto, não conseguem compreender as mudanças globais na expressão genética.

Aqui pretendemos usar uma bateria de ensaios para avaliação sistemática da diferenciação neuronal. Utilizando ambas as análises in vitro tradicionais em marcadores selecionados e RNA-seq, estabelecemos uma plataforma para medição da eficiência de diferenciação, bem como as alterações transcriômicas durante este processo. Com base em um protocolo previamente estabelecido7,geramos corpos embrionários (EBs) através da técnica de queda suspensa, seguidos pela indução usando quantidade suprafisiológica de ácido retinóico (RA) para gerar células progenitoras neurais (NPCs), que foram posteriormente diferenciadas aos neurônios com meio de indução neural. Para examinar a eficiência da diferenciação, além dos ensaios tradicionais de RT-qPCR e imunofluorescência (IF), realizamos RNA-seq e citometria de fluxo. Essas análises fornecem uma medição abrangente da progressão da diferenciação específica do estágio.

Protocol

1. cultura mESC Cubra uma placa tratada com 10 cm de tecido com gelatina de 0,1% e deixe que a gelatina se estafina por pelo menos 15-30 minutos antes de aspirar. Sementes γ camundongos embrionários (MEFs) um dia antes de cultivar os mESCs no meio mESC pré-aquecido (médio águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 15% de soro bovino fetal (FBS), aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)). <l…

Representative Results

Como representação do nosso método, realizamos um experimento de EB, NPC e diferenciação de neurônios em células E14. As células E14 foram cultivadas em MEFs irradiados γ(Figura 1A)até que a população de MEF irradiada γ diluída. Confirmamos a pluripotência das células E14 realizando coloração de Fosfattase Alcalina (AP)(Figura 1B)e posteriormente RT-qPCR (veja abaixo) para marcadores Nanog e Oct4. As células E14 sem MEF γ fo…

Discussion

O método de diferenciação neural de células-tronco embrionárias do camundongo foi estabelecido há décadas e os pesquisadores continuaram a modificar os protocolos anteriores ou criar novos para vários propósitos7,10,11. Utilizamos uma série de ensaios para analisar de forma abrangente a eficiência e o progresso das etapas de diferenciação dos mESCs aos neurônios, que podem ser utilizados na análise de outras difer…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (1R35GM133496-01) para Z. Gao. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ryan Hobbs pela ajuda na secção. Agradecemos as instalações principais da Penn State College of Medicine, incluindo as Ciências do Genoma e Bioinformática, a Imagem Avançada de Microscopia de Luz e a Citometria de Fluxo. Agradecemos também ao Dr. Yuka Imamura pela assistência na análise do RNA-seq.

Materials

0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X Corning 25-052-CV
0.1% Gelatin Sigma G1890-100G Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28908 Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer Falcon 352340
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11001 Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox Azura Genomics AZ-2105
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSCanto BD 657338
bFGF Sigma 11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Chir99021 Cayman Chemicals 13122
Chloroform C298-500 Fisher Chemical
DAPI Invitrogen R37606
DMEM Corning 10-017-CM
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320033
EB buffer Qiagen 19086
Ethanol 111000200 Pharmco Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY-401-2501
Isopropanol BDH1133-4LG BDH VWR Analytical Diluted in de-ionized water
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIF N/A N/A Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers IDTDNA N/A 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids Corning 25-025-Cl
mNanog primers IDTDNA N/A 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers IDTDNA N/A 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers IDTDNA N/A 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers IDTDNA N/A 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers IDTDNA N/A 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin primary antibody Millipore MAB5326 Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament primary antibody DSHB 2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit BioO Scientific NOVA-5138-07
PD0325901 Cayman Chemicals 13034
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A Prepared in de-ionized water
– Potassium chloride P217-500G VWR
– Potassium phosphate monobasic anhydrous 0781-500G VWR
– Sodium chloride BP358-10 Fisher Bioreagents
– Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate SX0715-1 Milipore
Random hexamer primer Thermo Scientific SO142
Retinoic acid Sigma R2625 Prepared in DMSO
Sodium pyruvate Corning 25-000-Cl
Sucrose Sigma 84097 Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen 18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583
TriPure Isolation Reagent Sigma-Aldrich 11667165001
TruSeq Rapid Illumina 20020616
β-mercaptoethanol Fisher BioReagents BP176-100

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hanafiah, A., Geng, Z., Wang, Q., Gao, Z. Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (159), e61446, doi:10.3791/61446 (2020).

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