Summary

التمايز وتوصيف السلف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Published: May 15, 2020
doi:

Summary

نحن نصف الإجراء للتمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الخلايا العصبية باستخدام طريقة إسقاط شنقا. وعلاوة على ذلك، نقوم بإجراء تحليل phenotypic شامل من خلال RT-qPCR، immunofluorescence، RNA-seq، وتدفق قياس الخلايا.

Abstract

نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لزراعة وتمييج الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الأنساب العصبية، تليها سلسلة من المقايسات لتوصيف الخلايا المتمايزة. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأرة E14 لتشكيل أجسام جنينية من خلال طريقة الإسقاط المعلق ، ثم تم حثها على التفريق إلى خلايا السلف العصبي بواسطة حمض الريتينويك ، وتم تمييزها أخيرا إلى خلايا عصبية. كشفت تجارب النسخ العكسي الكمي البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) وتجارب immunofluorescence أن السلف العصبي والخلايا العصبية تظهر علامات المقابلة (نستين للسلف العصبية والتشخيص العصبي للخلايا العصبية) في اليوم 8 و 12 بعد التمايز، على التوالي. أظهرت تجارب قياس التدفق الخلوي على خط E14 التي تعبر عن مراسل GFP مدفوع من قبل Sox1 أن حوالي 60٪ من الخلايا في اليوم 8 إيجابية GFP ، مما يشير إلى التمايز الناجح لخلايا السلف العصبي في هذه المرحلة. وأخيرا، استخدم تحليل الحمض النووي الريبي-seq لتحليل التغيرات العالمية في النسخ. هذه الأساليب مفيدة لتحليل مشاركة جينات ومسارات محددة في تنظيم انتقال هوية الخلية أثناء التمايز العصبي.

Introduction

منذ اشتقاقها الأول من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الكيسية الماوسالنامية 1،2، وقد استخدمت الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESC) كأدوات قوية لدراسة الخلايا الجذعية التجديد الذاتي والتمايز3. وعلاوة على ذلك، فإن دراسة التمايز mESC يؤدي إلى فهم هائل للآليات الجزيئية التي قد تحسن الكفاءة والسلامة في العلاج القائم على الخلايا الجذعية في علاج أمراض مثل الاضطرابات العصبية4. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية، يوفر هذا النظام في المختبر العديد من المزايا بما في ذلك البساطة في الممارسة والتقييم، وانخفاض التكلفة في الحفاظ على خطوط الخلايا على النقيض من الحيوانات، وسهولة نسبية في التلاعب الجيني. ومع ذلك، فإن كفاءة وجودة أنواع الخلايا المتمايزة تتأثر في كثير من الأحيان بخطوط مختلفة من mESCs وكذلك طرق التفريق5و6. كما أن المقايسات التقليدية لتقييم كفاءة التمايز تعتمد على الفحص النوعي لجينات العلامات المختارة التي تفتقر إلى القوة، وبالتالي فهي تفشل في فهم التغيرات العالمية في التعبير الجيني.

هنا نهدف إلى استخدام بطارية من المقايسات لتقييم منهجي للتمايز العصبي. باستخدام كل من التحليلات التقليدية في المختبر على علامات مختارة ورنا-seq، ونحن إنشاء منصة لقياس كفاءة التمايز، فضلا عن التغيرات النسخية خلال هذه العملية. استنادا إلى بروتوكولالمنشأةسابقا 7 , أنشأنا الأجسام الجنينية (EBs) من خلال تقنية إسقاط شنقا, تليها التعريفي باستخدام كمية فوقفيزيولوجية من حمض الريتينويك (RA) لتوليد خلايا السلف العصبية (NPCs), التي تم تمييزها في وقت لاحق إلى الخلايا العصبية مع وسيط التعريفي العصبي. لدراسة كفاءة التمايز ، بالإضافة إلى المقايسات التقليدية RT-qPCR والمناعة (IF) ، قمنا بإجراء قياس الخلايا الحمض النووي الريبي والتدفق. وتوفر هذه التحليلات قياسا شاملا لتطور التمايز الخاص بالمرحلة.

Protocol

1. ثقافة mESC معطف 10 سم الأنسجة الثقافة المعالجة لوحة مع 0.1٪ الجيلاتين والسماح للجيلاتين لتعيين ما لا يقل عن 15-30 دقيقة قبل أسبيراتينغ بها. البذور γ المشععة الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) قبل يوم واحد من زرع mESCs في المتوسط mESC قبل الاحماء (دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) مع 15٪ مصل…

Representative Results

كتمثيل لطريقتنا ، قمنا بإجراء تجربة تمايز EB و NPC والخلايا العصبية على خلايا E14. تم استزراع خلايا E14 على γ المشععة MEFs(الشكل 1A)حتى تم تخفيف مجموعة MEF المشععة γ. أكدنا pluripotency من الخلايا E14 من خلال أداء الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب)تلطيخ (الشكل 1B)وRT-qPCR في وقت لاحق (انظر أ…

Discussion

تم إنشاء طريقة التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس لعقود واستمر الباحثون في تعديل البروتوكولات السابقة أو إنشاء بروتوكولات جديدة لأغراض مختلفة7و10و11. استخدمنا سلسلة من المقايسات لتحليل شامل لكفاءة وتقدم مراحل التمايز من mESCs ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد القومية للصحة (1R35GM133496-01) إلى Z. Gao. نود أن نشكر الدكتور ريان هوبز على المساعدة في القسم. نشكر المرافق الأساسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب، بما في ذلك علوم الجينوم والمعلوماتية الحيوية، والتصوير المجهري الضوئي المتقدم، وقياس التدفق الخلوي. كما نشكر الدكتور يوكا إيمامورا على المساعدة في تحليل الحمض النووي الريبي.

Materials

0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X Corning 25-052-CV
0.1% Gelatin Sigma G1890-100G Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28908 Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer Falcon 352340
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11001 Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox Azura Genomics AZ-2105
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSCanto BD 657338
bFGF Sigma 11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Chir99021 Cayman Chemicals 13122
Chloroform C298-500 Fisher Chemical
DAPI Invitrogen R37606
DMEM Corning 10-017-CM
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320033
EB buffer Qiagen 19086
Ethanol 111000200 Pharmco Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY-401-2501
Isopropanol BDH1133-4LG BDH VWR Analytical Diluted in de-ionized water
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIF N/A N/A Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers IDTDNA N/A 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids Corning 25-025-Cl
mNanog primers IDTDNA N/A 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers IDTDNA N/A 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers IDTDNA N/A 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers IDTDNA N/A 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers IDTDNA N/A 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin primary antibody Millipore MAB5326 Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament primary antibody DSHB 2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit BioO Scientific NOVA-5138-07
PD0325901 Cayman Chemicals 13034
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A Prepared in de-ionized water
– Potassium chloride P217-500G VWR
– Potassium phosphate monobasic anhydrous 0781-500G VWR
– Sodium chloride BP358-10 Fisher Bioreagents
– Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate SX0715-1 Milipore
Random hexamer primer Thermo Scientific SO142
Retinoic acid Sigma R2625 Prepared in DMSO
Sodium pyruvate Corning 25-000-Cl
Sucrose Sigma 84097 Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen 18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583
TriPure Isolation Reagent Sigma-Aldrich 11667165001
TruSeq Rapid Illumina 20020616
β-mercaptoethanol Fisher BioReagents BP176-100

Riferimenti

  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Play Video

Citazione di questo articolo
Hanafiah, A., Geng, Z., Wang, Q., Gao, Z. Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (159), e61446, doi:10.3791/61446 (2020).

View Video