Дифференцировка и характеристика нейронных предшественников и нейронов из эмбриональных стволовых клеток мышей
Summary
Описана процедура дифференцировки in vitro эмбриональных стволовых клеток мышей в нейрональные клетки методом висячей капли. Кроме того, мы проводим комплексный фенотипический анализ с помощью RT-qPCR, иммунофлуоресценции, РНК-seq и проточной цитометрии.
Abstract
Мы описываем пошаговую процедуру культивирования и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в нейронные линии, за которой следует серия анализов для характеристики дифференцированных клеток. Эмбриональные стволовые клетки мыши E14 использовались для формирования эмбриональных тел с помощью метода висячей капли, а затем индуцировались для дифференцировки в нейронные клетки-предшественники ретиноевой кислотой и, наконец, дифференцировались в нейроны. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR) и эксперименты с иммунофлуоресценцией показали, что нейронные предшественники и нейроны демонстрируют соответствующие маркеры (нестин для нейронных предшественников и нейрофиламент для нейронов) на 8 и 12 день после дифференцировки соответственно. Эксперименты по проточной цитометрии на линии E14, экспрессирующей репортер GFP, управляемый промотором Sox1, показали, что около 60% клеток на 8-й день являются положительными GFP, что указывает на успешную дифференцировку нейронных клеток-предшественников на этом этапе. Наконец, анализ RNA-seq был использован для профилирования глобальных транскриптомных изменений. Эти методы полезны для анализа участия конкретных генов и путей в регулировании перехода клеточной идентичности во время дифференцировки нейронов.
Introduction
С момента их первого получения из внутренней клеточной массы развивающихся бластоцист мыши1,2,эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) использовались в качестве мощных инструментов для изучения самообновления и дифференцировки стволовых клеток3. Кроме того, изучение дифференциации mESC приводит к огромному пониманию молекулярных механизмов, которые могут повысить эффективность и безопасность терапии на основе стволовых клеток при лечении таких заболеваний, как нейродегенеративные расстройства4. По сравнению с животными моделями, эта система in vitro обеспечивает множество преимуществ, включая простоту в практике и оценке, низкую стоимость в поддержании клеточных линий в отличие от животных и относительную легкость в генетических манипуляциях. Однако на эффективность и качество дифференцированных типов клеток часто влияют различные линии мЭСК, а также методы дифференцировки5,6. Кроме того, традиционные анализы для оценки эффективности дифференцировки основаны на качественном исследовании выбранных маркерных генов, которым не хватает надежности, и поэтому они не могут понять глобальные изменения в экспрессии генов.
Здесь мы стремимся использовать батарею анализов для систематической оценки дифференцировки нейронов. Используя как традиционный анализ in vitro на выбранных маркерах, так и RNA-seq, мы создаем платформу для измерения эффективности дифференцировки, а также транскриптомных изменений во время этого процесса. Основываясь на ранее установленном протоколе7,мы генерировали эмбриоидные тела (ЭБ) с помощью метода висячей капли с последующей индукцией с использованием супрафизиологического количества ретиноевой кислоты (РА) для генерации нейронных клеток-предшественников (NPC), которые впоследствии были дифференцированы в нейроны с нейронной индукционной средой. Чтобы изучить эффективность дифференцировки, в дополнение к традиционным анализам RT-qPCR и иммунофлуоресценции (IF), мы выполнили РНК-seq и проточную цитометрию. Эти анализы обеспечивают всестороннее измерение прогрессии дифференцировки по специфической стадии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод нейронной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мышей был установлен в течение десятилетий, и исследователи продолжали модифицировать предыдущие протоколы или создавать новые для различных целей7,10,11. Мы использовали…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH (1R35GM133496-01) З. Гао. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Райана Хоббса за помощь в секционировании. Мы благодарим основные объекты Медицинского колледжа штата Пенсильвания, включая науки о геноме и биоинформатику, передовую визуализацию световой микроскопии и проточную цитометрию. Мы также благодарим доктора Юку Имамуру за помощь в анализе РНК-seq.
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
Riferimenti
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
