Somatische Mutationsmuster in Zellen spiegeln die vorherige mutagene Exposition wider und können Entwicklungslinienbeziehungen aufzeigen. Hier wird eine Methodik zum Katalogisieren und Analysieren somatischer Mutationen in einzelnen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen vorgestellt.
Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) akkumulieren während einer Lebensdauer allmählich DNA-Mutationen, die zu altersassoziierten Krankheiten wie Leukämie beitragen können. Die Charakterisierung der Mutationsakkumulation kann das Verständnis der Ätiologie altersassoziierter Krankheiten verbessern. Hier wird eine Methode vorgestellt, um somatische Mutationen in einzelnen HSPCs zu katalogisieren, die auf der Ganzgenomsequenzierung (WGS) klonaler Primärzellkulturen basiert. Mutationen, die in der ursprünglichen Zelle vorhanden sind, werden von allen Zellen in der Klonkultur geteilt, während Mutationen, die in vitro nach der Zellsortierung erworben wurden, in einer Teilmenge von Zellen vorhanden sind. Daher ermöglicht diese Methode den genauen Nachweis somatischer Mutationen in den Genomen einzelner HSPCs, die sich im Laufe des Lebens ansammeln. Diese Kataloge somatischer Mutationen können wertvolle Einblicke in mutationsaktive Mutationsprozesse im hämatopoetischen Gewebe liefern und wie diese Prozesse zur Leukemogenese beitragen. Darüber hinaus können durch die Bewertung somatischer Mutationen, die zwischen mehreren HSPCs desselben Individuums geteilt werden, klonale Abstammungsbeziehungen und populationsische Dynamiken von Blutpopulationen bestimmt werden. Da dieser Ansatz auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen beruht, ist die Methode auf hämatopoetische Zellen mit ausreichendem replizierendem Potenzial beschränkt.
Die Exposition hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) gegenüber endogenen oder extrinsischen mutagenen mutagenen erbgutverändernden Quellen trägt zur allmählichen Ansammlung von Mutationen in der DNA während einer Lebensdauer1bei. Die allmähliche Mutationsakkumulation in HSPCs1 kann zu altersbedingter klonaler Hämatopoese (ARCH)2,3führen, was ein nicht symptomatischer Zustand ist, der von HSPCs angetrieben wird, die Leukämie-Treibermutationen tragen. Anfangs wurde angenommen, dass Personen mit ARCH ein erhöhtes Risiko für Leukämie haben2,3. Jedoch, neuere Studien haben gezeigt, dass eine Inzidenz von 95% der ARCH bei älteren Menschen4, so dass die Assoziation mit bösartigenErkrankungen weniger klar und wirft die Frage, warum einige Personen mit ARCH schließlich tun oder nicht entwickeln Malignitäten. Dennoch können somatische Mutationen in HSPCs ernste Gesundheitsrisiken darstellen, da myelodysplastische Störungen und Leukämie durch das Vorhandensein spezifischer Krebstreibermutationen gekennzeichnet sind.
Um die Mutationsprozesse zu identifizieren und die Klonalität des Blutes zu untersuchen, muss die Mutationsakkumulation in einzelnen HSPCs charakterisiert werden. Mutationsprozesse hinterlassen charakteristische Muster im Genom, sogenannte Mutationssignaturen, die in genomweiten Mutationssammlungen identifiziert und quantifiziert werden können5. Zum Beispiel wurden die Exposition gegenüber UV-Licht, Alkylierungsmitteln und Defekten in DNA-Reparaturwegen jeweils mit einer anderen Mutationssignatur in Verbindung gebracht6,7. Darüber hinaus sind aufgrund der stochastischen Natur von Mutationsakkumulationen die meisten (wenn nicht alle) der erworbenen Mutationen zwischen den Zellen einzigartig. Wenn Mutationen zwischen mehreren Zellen desselben Individuums geteilt werden, bedeutet dies, dass diese Zellen einen gemeinsamen Vorfahr e. Werthaben 8. Daher können durch die Bewertung gemeinsamer Mutationen Linienbeziehungen zwischen Zellen bestimmt werden, und ein Entwicklungslinienbaum kann verzweigt nach Zweig enzaust erstellt werden. Die Katalogisierung seltener somatischer Mutationen in physiologisch normalen Zellen ist jedoch aufgrund der polyklonalen Natur gesunder Gewebe technisch eine Herausforderung.
Hier wird eine Methode vorgestellt, um somatische Mutationen in den Genomen einzelner HSPCs genau zu identifizieren und zu bestimmen. Dies beinhaltet die Isolierung und klonale Expansion von HSPCs in vitro. Diese klonalen Kulturen spiegeln die genetische Zusammensetzung der ursprünglichen Zelle wider (d. h., Mutationen in der ursprünglichen Zelle werden von allen anderen Zellen in der Kultur geteilt). Dieser Ansatz ermöglicht es uns, genügend DNA für die gesamte Genomsequenzierung (WGS) zu erhalten. Wir haben bereits gezeigt, dass Mutationen, die sich in vitro während der klonalen Kultur angesammelt haben, von einer Teilmenge von Zellen geteilt werden. Dies ermöglicht die Filterung aller In-vitro-Mutationen, da diese in einem kleineren Bruchteil der Lesevorgänge im Vergleich zu in vivo erworbenen Mutationen9vorhanden sein werden. Frühere Methoden haben ausreichende DNA aus einer einzelzelle für WGS mit Vollgenom-Amplifikation (WGA)10erhalten. Der Hauptnachteil von WGA ist jedoch seine relativ fehleranfällige und unausgewogene Verstärkung des Genoms, die zu Allele-Aussetzern führen kann11. Da dieser Ansatz jedoch auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen beruht, ist er auf Blutzellen mit ausreichendem replizitivem Potenzial beschränkt, was bei WGA-abhängigen Methoden nicht der Fall ist. Frühere Bemühungen, klonale Kulturen zu sequenzieren, haben sich auf die Verwendung von Feederschichten verlassen, um die klonale Verstärkung einzelner HSPCs zu gewährleisten12. DNA aus den Feederschichten kann jedoch potenziell die DNA der Klonkulturen kontaminieren und die anschließende Mutationsaufruf und -filterung verwirren. Die hier vorgestellte Methode beruht ausschließlich auf spezifizierten Datenträgern, um einzelne HSPCs klonal zu erweitern, und vermeidet somit das Problem der DNA-Kontamination. Bisher haben wir diese Methode erfolgreich auf menschliches Knochenmark, Nabelschnurblut, viably gefrorenes Knochenmark und peripheres Blut angewendet.
Hier wird eine Methode vorgestellt, um Mutationen zu erkennen, die sich während des Lebens in einzelnen HSPCs angesammelt haben, und um einen frühen Entwicklungslinienbaum mit diesen Mutationsdaten zu konstruieren.
Für eine erfolgreiche Durchführung dieser Tests müssen mehrere kritische Anforderungen erfüllt werden. Erstens muss die Lebensfähigkeit der Probe sichergestellt werden. Die schnelle Handhabung der Probe ist der Schlüssel, um die Effizienz des Verfahrens zu gewährleisten. Zweitens wird sich der Verlust der Wachstumsfaktor-Potenz negativ auf die klonale Expansion von HSPCs auswirken. Um eine hohe Wirksamkeit des Wachstumsfaktors zu gewährleisten, ist es wichtig, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden und Einweg-Aliquots vorzubereiten. Drittens ist es nach der Durchführung von WGS, Mutationsaufruf und Filterung von entscheidender Bedeutung, die Klonalität der Klonkultur zu validieren. Um die Klonalität der Kultur zu bestätigen, sollte sich der VAF der Mutationen in einer karyotypischen normalen Probe um 0,5 gruppieren (Abbildung 3). In Zellen mit geringer Mutationslast, wie Zabelschnurblut-HSPCs, ist es aufgrund der geringen Mutationszahlen schwieriger, die Klonalität zu bestimmen.
Unser Ansatz beruht auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen, um WGS zu ermöglichen. Daher ist unser Ansatz auf Zellen beschränkt, die das replikierende Potenzial haben, klonal zu erweitern, z. B. HSPCs. In unseren Händen sind etwa 5%-30% aller einsortierten Zellen in der Lage, sich angemessen auszudehnen. Reduzierte Auswuchsraten können möglicherweise zu einer Auswahlverzerrung führen. Wie bereits erläutert, können Methoden, die WGA verwenden, diese Selektionsverzerrung überwinden, da diese Technik nicht auf der Erweiterung von Zellen beruht. Allerdings hat WGA seine eigenen Mängel, und die klonale Amplifikation bleibt die einzige Methode, um die Anzahl der Mutationen im gesamten Genom ohne Allelic-Aussetzer und gleiche Abdeckung entlang des Genoms genau zu bestimmen, insbesondere in Proben mit niedrigem Mutationszahlen.
Die mit diesem Ansatz generierten Daten können verwendet werden, um Phylogenitäten des hämatopoetischen Systems zu bestimmen, da die in einzelnen Zellen erkannten Mutationen verwendet werden können, um Zelllinien zu sezieren, wie in Abbildung 6dargestellt. In der Regel können ein oder zwei Mutationen jeden Zweig in einem gesunden Spender definieren1. Da Linien früh nach der Empfängnis verzweigen, werden Mutationen, die diese ersten Zweige definieren, auch mit einem niedrigen VAF in der übereinstimmenden normalen Probe vorhanden sein, die zum Filtern der Keimbahnvarianten1,18,19verwendet wurde. In diesem Fall wird die Verwendung von nicht-hämatopoetischen Zellen, wie MSCs, bevorzugt, da erwartet wird, dass sie sich sehr früh während der Entwicklung vom hämatopoetischen System trennen. Da T-Zellen hämatopoetischen Ursprungs sind, könnte die Verwendung dieser Zellen als abgestimmte normale Probe zum Filtern von Keimbahnvarianten daher die Konstruktion der frühesten Verzweigung des Entwicklungslinienbaums verwirren. Das subklonale Vorhandensein von astspezifischen Mutationen in bestimmten reifen Blutpopulationen, die durch gezielte tiefe Sequenzierung gemessen werden können, wird darauf hindeuten, dass die Nachkommen dieses Zweigs zu diesem reifen Zelltyp führen kann. Darüber hinaus ermöglicht unser Ansatz die Bewertung der mutationsischen Folgen einer mutagenen Exposition in vivo und letztlich, wie dies zur Entwicklung der Leukämie beitragen kann.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde durch ein VIDI-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Nr. 016.Vidi.171.023) an R. v. B. unterstützt.
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |