Caracterización de la carga mutacional y la composición clonal de la sangre humana

Las muestras deben obtenerse de acuerdo con los protocolos de ética apropiados, y los donantes deben dar su consentimiento informado antes del procedimiento. 1. Preparación del material de muestra NOTA: Cuando trabaje con material recién obtenido, comience con el paso 1.1. Cuando trabaje con material congelado, comience con el paso 1.2. Preparación de médula ósea fresca, sangre de cordón umbilical o sangre periférica Aísle la fracción mononuclear de la muestra utilizando la separación de gradiente de densidad siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales)y cuente las células mononucleares utilizando un hemocitómetro. Después del aislamiento de las células mononucleares, continúe con el paso 1.3. OPCIONAL: El número recomendado de células necesarias para ordenar una placa completa de 384 pozos de HSCCP es 1–2 x 107. Si se aíslan más células durante la centrifugación de gradiente de densidad, almacene el excedente de células en nitrógeno líquido. Resuspenda las celdas en 500 oL de IMDM + 10% FBS por 1 x 107 celdas, y agregue drop-by-drop un volumen igual de IMDM + 30% FBS + 20% DMSO para lograr una suspensión de 1 x 107 celdas en 1 mL de IMDM + 20% FBS + 10% DMSO. Transfiera inmediatamente las células mononucleares a viales criogénicos de 1 ml y las células de congelación a -80 oC en un recipiente de congelación de células de velocidad controlada durante la noche. Transfiera las células al día siguiente a un almacenamiento de nitrógeno líquido tras su posterior procesamiento. Preparación de células mononucleares congeladas de la médula ósea, la sangre del cordón umbilical o la sangre periférica Preparar 50 ml de medio de descongelación celular que contenga 45 ml del medio de águila modificada (IMDM) de Iscove y 5 ml de suero bovino fetal (FBS), y calentar en un baño de agua de 37 oC. Tomar el vial que contiene la muestra del almacenamiento de nitrógeno líquido, transferir la muestra al hielo seco y descongelar lo antes posible en un baño de agua de 37 oC. Cuando la muestra esté casi desconsadesalida, limpie el vial con 70% de etanol y transfiera su contenido a un tubo cónico de 50 ml. Enjuague el vial con 1 ml de IMDM precalentado + 10% FBS para recoger las celdas restantes, y agregue esta solución en sentido de gota (5 s por gota) a la muestra descongelada mientras arremolina suavemente el tubo. Agregue un adicional de 15 ml de IMDM + 10% FBS en sentido lento a la muestra mientras arremolina suavemente el tubo. Pellet las células por centrifugación durante 5 min a 350 x g. Retire todos los 3 ml menos de 3 ml del sobrenadante. Resuspenda las células en el sobrenadante restante y diluya añadiendo 20 ml de IMDM + 10% FBS gota a gota mientras agita suavemente el tubo. Tomar 10 s de la suspensión celular para el conteo celular. Diluir estos 10 l agregando 20 sl de solución azul trypan al 0,4% y contar las células usando un hemocitómetro. El número de células puede disminuir al descongelarse, con hasta un 50% de pérdida de células después de descongelarse. La viabilidad celular debe oscilar entre 70% y 90%. Si trabaja con células sanguíneas de médula ósea o de cordón umbilical, tome 5 x 106 células mononucleares para el cultivo de MSC (paso 2.1). Si trabaja con sangre periférica, tome 2–5 x 106 células para el aislamiento de células T (paso 2.2) Células restantes de pellets 5 min a 350 x g y resuspenden en 3 ml de búfer FACS (0,05% BSA + 1 mM EDTA en PBS). Transfiera 1 x 105 células a un microtubo lleno con 200 ml de tampón FACS, que servirá como un control negativo para la citometría de flujo (paso 3.8), y manténgalo en hielo. 2. Cultivo celular NOTA: Para obtener catálogos de mutaciones adquiridas somáticamente, es necesario filtrar la variación de la línea germinal específica del donante. Cuando se inician biopsias de médula ósea o sangre de cordón umbilical, las células estromales mesenquimales (MSC) se pueden utilizar como control coincidente para filtrar la variación de la línea germinal. En este caso, siga la sección 2.1. Cuando utilice sangre periférica (movilizada) siga el paso 2.2 para aislar y utilizar células T como muestra de control coincidente para filtrar la variación de la línea germinal (Figura1). La población masiva de células T compartirá la misma relación de linaje que los HSCCP. Cultura MSC Preparar 50 ml de medio MSC que contenga 45 ml de medio DMEM/F12, 10% FBS, 500 ml de alternativa de trippsina o trippsina y 500 ml de solución de penicilina/estreptomicina. Placa aproximadamente 5 x 105 células mononucleares en 1,5 ml de medio MSC por pozo. Colocar las células en una incubadora humidificadaa 37oC con un 5% de CO2. Reemplazar el medio después de 24 h, y posteriormente reemplazar el medio cada 3 días para asegurarse de que todas las células hematopoyéticas se lavan. Continúe cultivando hasta que la confluencia sea del 100%. Si los MSC son confluentes, lave las células con 1 ml de PBS y cosecha los MSC agregando 200 sL de trypsin o trypsin alternativa por pozo. Incubar células durante 5 min a 37oC. Agregue 800 s de medio MSC y encadene las células hacia arriba y hacia abajo para aflojar las células de la placa del pozo. Transfiera los MSC al tubo de microcentrífuga y replete las células por centrifugación durante 5 min a 350 x g. Retire el sobrenadante y continúe con el aislamiento del ADN o almacene el pellet a -20 oC para un aislamiento posterior del ADN (sección 4). Aislamiento de células TNOTA: Si se utiliza sangre periférica (movilizada), las células T se pueden aislar y utilizar como control de la línea germinal. Resuspender el gránulo celular en 100 l de solución de tinción anti-CD3 (dilución 1:100 de anticuerpo anti-CD en tampón FACS). Lave las células agregando 1 ml de búfer FACS. Reventar las células por centrifugación durante 5 min a 350 x g y resuspender en 300 s de tampón FACS. Aísle al menos 5 x 105 células CD3+ utilizando un clasificador FACS en un tubo de poliestireno de 5 ml precargado con 1 ml de FBS. Reventar las células clasificadas utilizando centrifugación durante 5 min a 350 x g, eliminar el sobrenadante, y continuar directamente con aislamiento de ADN (sección 4) o almacenar el pellet a -20 oC para un posterior aislamiento del ADN. 3. Aislamiento, clasificación y cultura de HSPC Gire hacia abajo a 1–2 x 107 células mononucleares durante 5 min a 350 x g y resuspende en 50 s de tampón FACS (ver paso 2.2.1). Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga.NOTA: Al ordenar con >2 x 107 células, aumente la mezcla de anticuerpos y los volúmenes de búfer FACS en consecuencia. Preparar 50 l de mezcla de tinción HSC 2x de acuerdo con la receta que se ve en la Tabla1. Anticuerpo volumen [L] BV421-CD34 5 Mezcla FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56) 5 PE-CD38 2 APC- CD90 0.5 PerCP/Cy5.5 – CD45RA 5 PE/Cy7- CD49f 1 FITC -CD16 1 FITC-CD11 5 Zona de influencia FACS 25.5 Tabla 1: Mezcla de clasificación HSC. Se muestra una tabla que indica las diluciones de los anticuerpos utilizados para ordenar los HSC. Mezclar 50 ml de solución celular con la mezcla de tinción HSC preparada e incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) o durante 1 h sobre hielo para que los anticuerpos se adhieran. Lave las células añadiendo 1 ml de tampón FACS y pellet mediante centrifugación durante 5 min a 350 x g. Resuspenda las células en 300 ml de tampón FACS y filtre la suspensión celular a través de un tubo de poliestireno de 5 ml con tapa de celda de 35 m para eliminar los grumos celulares antes de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Preparar 25 ml de medio de cultivo HSPC, compuesto por 1x medio SFEM complementado con 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL- 6 y formulación de antibióticos de 100 ng/mL (ver Tabla de Materiales). Llene una placa de cultivo de celda de pozo de 384 pozos con 75 ml de medio de cultivo HSPC en cada pocal.NOTA: Para evitar la evaporación del medio en los pozos exteriores, llene los pozos exteriores con 75 ml de agua estéril o PBS, y no utilice estos pozos para la clasificación celular. Clasificación de HSCCP individuales Establezca puertas para la clasificación de HSPC en función de un control sin mancha (paso 1.9) y 10.000 celdas de la muestra manchada. En la Figura 1se muestra un resultado representativo para establecer puertas. Compuerta las celdas individuales dibujando una puerta alrededor de la altura lineal FSC frente a la fracción del área FSC. Utilice la fracción de control sin mancha para dibujar la puerta para el linaje- fracción. Dibuje puertas para CD34+ celdas y caracterice aún más este subconjunto estableciendo una puerta específica para las celdas CD38- CD45RA – . Cargue la placa de pozo 384 en la máquina FACS y ordene las células individuales.NOTA: Si es aplicable a la máquina FACS, active la opción para mantener los datos de ordenación de índices para habilitar el seguimiento de las celdas ordenadas. Culturing HSCs clasificados por separado Transfiera directamente la placa de pozo 384 a una incubadorahumidificada de 37 oC con un 5% de CO2.NOTA: Para evitar la evaporación durante el cultivo, envuelva la placa de cultivo de pozo 384 (con tapa) en envoltura de polietileno transparente. Mantenga la placa de pozo 384 en la incubadora durante 3-4 semanas hasta que aparezcan clones visibles. Las imágenes representativas de la cultura clonal se muestran en la Figura2. Según la condición del material de entrada 5%–30% de las celdas clasificadas se expandirán clonalmente. 4. Cosecha de clones HSPC Después de 4 semanas de cultivo, determinar qué pozos tienen una confluencia de 30% o más. Pre-llenado (para cada crecimiento clonal) 1,5 ml de microtubos con 1 ml de 1% de BSA en PBS y etiquetar el tubo de acuerdo con el pozo correspondiente. Humedezca previamente una punta de pipeta con 1% de BSA en PBS para minimizar el número de células que se adhieren a la punta de la pipeta. Entubar/bajar el medio en el pozo ferozmente (al menos 5 veces) con una pipeta de 200 l (establecida en 75 l) y raspar la parte inferior del pozo para aflojar las células en el pozo, y recoger la suspensión celular en el microtubo etiquetado correspondiente al pozo. Tome 75 ol de BSA fresco 1% en PBS y repita el pipeteo en el pozo para asegurar la máxima toma de células.NOTA: Las células cultivadas clonalmente pueden pegarse al fondo del pozo. Inspeccione los pozos utilizando un microscopio de luz invertida estándar para asegurarse de si se han recogido todas las células. Si se han cosechado todos los pozos con >30% de confluencia, vuelva a colocar la placa de 384 pozos en la incubadora. Los cultivos clonales pueden proliferar hasta 5 semanas. Gire hacia abajo la suspensión de la celda durante 5 min a 350 x g. Un pequeño pellet debe ser visible. Retirar con cuidado todos los aproximadamente 5 l de sobrenadante. Los gránulos celulares se pueden congelar a -20 oC y almacenarse durante varios meses antes del aislamiento del ADN. 5. Aislamiento de ADN Aísle el ADN de HSPC y MSC/Células T utilizando un kit de aislamiento de ADN a microescala de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los siguientes ajustes: Añadir 2 l de RNase A después de la adición del tampón AL durante la sección 2. Incubar durante 2 min antes de añadir la proteinasa K. Incubar durante 30 min a 56oC en lugar de 10 min. Elule el ADN cargando la columna con 50 l de tampón TE con EDTA bajo (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). Para una elución óptima, vuelva a cargar el eluido en la columna y vuelva a girar. Determinar la concentración de ADN utilizando un ADN de 2 ml por clon. El rendimiento del ADN varía típicamente entre 0.5–3 ng/L. 6. Secuenciación Realizar la secuenciación del ADN como se describe en Jager et al. 7. Mapeo y llamada de mutación somática Asigne la salida de secuenciación (archivos FASTQ) al genoma de referencia y llame mutaciones como se describe en Jager et al. Inspeccione los datos en busca de cambios kársticos en clones secuenciados y datos masivos utilizando una herramienta de análisis de números de copia, como Control-FreeC14. Hasta ahora, no hemos reportado ningún HSpaCs con abelancias kariotípicas. Genere una lista negra, que consta de un panel de muestras normales no coincidentes con fines de filtrado a partir de un conjunto propio de muestras, como se describió anteriormente13,o utilice la siguiente lista negra cargada: . Filtre variaciones de nucleótidos individuales mediante SNVFI . Archivo SNVFI.config predefinido, de modo que todas las rutas de acceso a las funciones auxiliares sean correctas. Ejecute SNVFI con el archivo .ini configurado de acuerdo con las configuraciones vistas en el archivo suplementario 1 (SNVFI.ini). Para excluir mutaciones inducidas in vitro, filtramos por un VAF de 0,39. Compruebe la salida de la fracción de alelo variante (VAF) de SNVFI (Figura4). Compruebe si el pico de la gráfica de densidad está cerca de 0,5, lo que indica que la muestra es clonal. OPCIONAL: Para determinar la parte del genoma que se cubre durante el filtrado, determine las regiones invocables a lo largo de la línea germinal y controle mediante CallableLoci de GATK (Genome Analysis ToolKit):java -jar GenomeAnalysisTK.jar ?-T CallableLoci ?-R reference.fasta ?-I myreads.bam ?-resumen table.txt ?-o callable_status.bed OPCIONAL: Recupere las regiones invocables de la salida CallableLoci y realice intersecciones en pares entre los ejemplos y el volumen mediante la secuencia de comandos python CallableLoci_processor.py presente en https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Los archivos de cama resultantes se pueden utilizar para filtrar aún más la salida de SNVFI e inspeccionar el perfil mutacional en la sección 9:CallableLoci_processor.py dir_in dir_out nombre_muestra bulk_name –muestras sample1 sample2 sample3 8. Llamadas indel Seleccione todas las inserciones y eliminaciones (Indels) en el archivo raw_variants.vcf utilizando GATK SelectVariants:java -Xmx12G ?-jar GenomeAnalysisTK.jar ?-T SelectVariants ?-R reference_genome.fasta ?-V raw_variants.vcf ?-o raw_INDELs.vcf ?-selectType INDEL Filtrar la lista raw_INDELS.vcf mediante INDELFI :perl INDELFI.pl -i input.vcf (del paso 8.1)-s muestra de prueba de columna ?-c muestra de control de columna 9. Inspección de perfil esmutacional Utilice los archivos .vcf resultantes de la salida SNVFI del paso 7.6 (o del paso 7.9 con análisis de loci invocables opcionales) para analizar el perfil mutacional genómico, los tipos de mutación y el análisis de firmas utilizando el paquete R MutationalPatterns15: . Para obtener una salida representativa que se puede producir con el archivo .vcf resultante, como un espectro mutacional 96-trinucleótido, consulte la Figura5. 10. Construcción de un árbol de linaje de desarrollo utilizando sustituciones de base Para construir un árbol de linaje de desarrollo, detecte mutaciones compartidas entre clones. Las mutaciones presentes en las primeras ramas del árbol de linaje también pueden estar presentes subclonalmente en la muestra a granel (MSCs/células T). Los linajes de ramificación posteriores se definirán mediante mutaciones compartidas únicamente por clones de HSPC. Para identificar las mutaciones que están presentes en un subconjunto de los clones y subclonalmente presentes en el grueso, realice los pasos siguientes. Para filtrar las mutaciones somáticas compartidas entre clones, ejecute el script filterSomatic.py en un terminal basado en Unix. El script se puede encontrar en https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Antes de ejecutar este script, edite el archivo filterSomatic.ini (consulte Archivo suplementario 2) para establecer las rutas y ajustar los demás parámetros. Ejecute filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini). Filtre las mutaciones que están subclonalmente presentes en el grueso utilizando Determine_lowVAF_bulk. Script R en un terminal basado en Unix. El script se puede encontrar en https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Esto generará archivos .vcf independientes para SNVs compartidos y únicos:Rscript Determine_lowVAF_bulk. R–vcf Path/To/Filter_somatic_output.vcf–bulk_name–sample_name sample-name–género [M- F]–out_dir out_dir Determinar todas las mutaciones compartidas entre clones que no están presentes en la muestra a granel superponiendo todas las posiciones de mutación (concatenar las columnas 1 y 2 de la salida SNVFI). Excluir falsos positivos obtenidos durante los pasos 10.5 y 10.6 mediante inspección manual utilizando IGV16. Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes, cuando la mutación está presente en la línea germinal o cuando está presente en regiones mal mapeadas, véase la Figura7.NOTA: Recomendamos encarecidamente volver a secuenciar todos los loci compartidos de forma independiente mediante la secuenciación dirigida o de sanger. Utilice las mutaciones compartidas obtenidas durante los pasos 10.1 y 10.2 para construir una tabla binaria de mutaciones frente a clones secuenciados, con 0 indicando que la mutación no está presente y 1 indicando la presencia de la mutación. Salida de la tabla binaria de mutación como en un mapa de calor junto con un dendrograma que indica las relaciones de linaje entre las células utilizando R. El mapa de calor indica el estado de las mutaciones para cada célula. Vea la salida de esta función (Figura 6).         Clones <- read.table("Path/To/BinaryTable")         my_palette <- colorRampPalette(c("#cccccc", "#333333"))(n s 2)col_breaks <- c(0,0.5,1)         heatmap.2(clones, distfun-function(x) dist(x,method á ‘binary’),hclustfun-function(x) hclust(x,method – average),dendrograma – “columna”, Rowv a F,col-my_palette, breaks-col_breaks,trace”none”, density.info-“none”)