Характеристика мутационной нагрузки и клональная композиция человеческой крови

Образцы должны быть получены в соответствии с соответствующими протоколами этики, и доноры должны дать информированное согласие до процедуры. 1. Подготовка образцового материала ПРИМЕЧАНИЕ: При работе со свежеполученным материалом начните с шага 1.1. При работе с замороженным материалом начните с шага 1.2. Подготовка свежего костного мозга, пуповинной крови или периферической крови Изолировать моноядерную фракцию из образца, используя разделение градиента плотности, следуя инструкциям производителей (см. ТаблицуМатериалов), и подсчитайте моноядерные клетки с помощью геоцитометра. После изоляции моноядерных клеток продолжайте шаг 1.3. ФАЦИАЛЦИЯ: Рекомендуемое количество клеток, необходимых для сортировки полной 384 хорошо пластины HSPCs составляет 1-2 х 107. Если больше клеток изолированы во время градиентного центрифугирования градиента плотности, храните излишки клеток в жидком азоте. Повторное отсеивайте ячейки в 500 л IMDM и 10% FBS на 1 х 107 ячеек, и добавить падение за падением равный объем IMDM и 30% FBS и 20% DMSO для достижения подвески 1 х 107 клеток в 1 мл IMDM и 20% FBS и 10% DMSO. Немедленно перенесите моноядерные клетки в криогенные флаконы 1 мл и заморозьте клетки при -80 градусов по Цельсию в контейнере для замораживания клеток с контролируемой скоростью на ночь. Передача клеток на следующий день в хранилище жидкого азота при дальнейшей обработке. Подготовка замороженных моноядерных клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови Приготовьте 50 мл клеточной оттаивательной среды, содержащей 45 мл модифицированного орла (IMDM) и 5 мл сыворотки для крупного рогатого скота (FBS), и прогрейте в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Возьмите флакон, содержащий образец из хранилища жидкого азота, перенесите образец на сухой лед и как можно быстрее оттаивайте в водяной бане 37 градусов. Когда образец почти разморозиться, протрите флакон с 70% этанола и перенести его содержимое в 50 мл конической трубки. Промыть флакон с 1 мл предварительно разогретого IMDM и 10% FBS, чтобы собрать оставшиеся клетки, и добавить это решение dropwise (5 с за каплю) в оттаявшей образец в то время как мягко закрученного трубки. Добавьте дополнительные предварительно разогретые 15 мл IMDM и 10% FBS dropwise к образцу, нежно закрученного трубки. Пелле клетки центрифугации в течение 5 мин при 350 х г. Удалите все, кроме 3 мл супернатанта. Resuspend клетки в оставшихся супернатант и разбавить, добавив 20 мл IMDM и 10% FBS падение за каплей в то время как мягко встряхивая трубку. Возьмите 10 зЛ суспензии клетки для подсчета клеток. Разбавить эти 10 л, добавив 20 qL 0,4% trypan синий раствор и рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра. Число клеток может уменьшаться при оттаивании, с потерей до 50% клеток после оттаивания. Жизнеспособность клеток должна варьироваться от 70% до 90%. При работе с клетками костного мозга или пуповинной крови, возьмите 5 х 106 моноядерных клеток для культуры MSC (шаг 2.1). При работе с периферической кровью, возьмите 2-5 х 106 клеток для изоляции Т-клеток (шаг 2.2) Пеллетные оставшиеся клетки 5 мин при 350 х г и повторно в 3 мл буфера FACS (0,05% BSA и 1 мМ EDTA в PBS). Передача 1 х 105 клеток в микротрубку, наполненную 200 злицу буфера FACS, который будет служить негативным контролем для цитометрии потока (шаг 3.8), и держать на льду. 2. Культура клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения каталогов соматически приобретенных мутаций необходимо отфильтровать специфические для доноров вариации зародышевой линии. При запуске с биопсии костного мозга или пуповинной крови, мезенхимальные стромальные клетки (MSC) могут быть использованы в качестве соответствующей контроля для фильтрации для изменения зародышевой линии. В этом случае следуйте разделу 2.1. При использовании (мобилизованной) периферической крови следуйте шагу 2.2, чтобы изолировать и использовать Т-клетки в качестве сопоставленного контрольного образца для фильтрации зародышевой вариации (Рисунок 1). Основная популяция Т-клеток будет разделять те же отношения линии, что и HSPCs. Культура MSC Подготовьте 50 мл среды MSC, содержащей 45 мл среднего DMEM/F12, 10% FBS, 500 л трипсина или альтернативного трипсина, и 500 л раствора пенициллина/стрептомицина. Плита примерно 5 х 105 моноядерных клеток в 1,5 мл среднего MSC на скважину. Поместите клетки в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Замените среду после 24 ч, а затем заменить средний каждые 3 дня, чтобы убедиться, что все гематопоитические клетки смываются. Продолжайте культуру до 100%. Если MSCs являются сливочными, мыть клетки с 1 мл PBS и урожай MSCs, добавив 200 зл. трипсина или трипсина альтернатива в скважине. Инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Добавьте 800 кл. среднего MSC, и pipet клетки вверх и вниз, чтобы ослабить клетки из скважины пластины. Передача MSCs в микроцентрифуг трубки и гранулы клетки центрифугации в течение 5 мин при 350 х г. Удалить супернатант и продолжить изоляцию ДНК или хранить гранулы при -20 градусов по Цельсию для последующей изоляции ДНК (раздел 4). Изоляция Т-клетокПРИМЕЧАНИЕ: При использовании (мобилизованной) периферической крови, Т-клетки могут быть изолированы и использованы в качестве контроля зародышей. Приостановите действие клеточных гранул в 100 злиц анти-CD3 окрашивающий раствор (1:100 разбавления анти-CD антитела в буфере FACS). Вымойте ячейки, добавив 1 мл буфера FACS. Пелле клетки центрифугации в течение 5 мин при 350 х г и повторно в 300 л буфера FACS. Изолировать по крайней мере 5 х 105 CD3 “клеток с помощью FACS-сортировки в 5 мл полистирола трубки предварительно заполнены 1 мл FBS. Пеллет сортированные клетки с помощью центрифугации в течение 5 мин при 350 х г, удалить супернатант, и продолжить непосредственно с изоляцией ДНК (раздел 4) или хранить гранулы при -20 градусов по Цельсию для последующей изоляции ДНК. 3. Изоляция, сортировка и культура HSPC Спин вниз на 1-2 х 107 моноядерных клеток в течение 5 мин на 350 х г и повторно в 50 л буфера FACS (см. шаг 2.2.1). Перенесите клетки в микроцентрифугную трубку.ПРИМЕЧАНИЕ: При сортировке с йgt;2 х 107 клеток, увеличить смесь антител и FACS объемы буфера соответственно. Приготовьте 50 зл 2x HSC окрашивающей смесь в соответствии с рецептом, увиденным в таблице1. Антитела объем «L» BV421-CD34 5 Смесь FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56) 5 PE-CD38 2 APC- CD90 0,5 PerCP/Cy5.5 – CD45RA 5 PE/Cy7- CD49f 1 FITC -CD16 1 FITC-CD11 5 FACS Буфер 25,5 Таблица 1: Сортировка HSC смеси. Показана таблица, указывающая на разбавления антител, используемых для сортировки ГХК. Смешайте 50 зл клеточного раствора с готовой смесью окрашивания HSC и инкубируете клетки в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) или на 1 ч на льду для связывания антител. Вымойте клетки, добавив 1 мл буфера FACS и гранулы центрифуги в течение 5 мин при 350 х г. Resuspend клетки в 300 зЛ буфера FACS и фильтровывать подвеску клетки через 35 мкм ячейки ситечко-крышка 5 мл полистирола трубки для удаления клеточных сгустков до флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Подготовка 25 мл среды культуры HSPC, состоящая из 1x SFEM среднего дополнен 100 нг/мЛ SCF, 100 нг/мл Flt3, 50 нг/мл TPO, 10 нг/мл Ил-3, 20 нг/мл IL- 6, и 100 нг/мл антибиотика формулировки (см. Таблица материалов). Заполните 384 хорошо пластины культуры клеток с 75 Зл культуры среды HSPC в каждом колодце.ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения испарения среды во внешних скважинах, заполнить внешние скважины с 75 л стерильной воды или PBS, и не использовать эти скважины для сортировки клеток. Сортировка одного HSPCs Установите ворота для сортировки HSPC на основе неокрашенного элемента управления (шаг 1.9) и 10 000 ячеек из окрашенного образца. Репрезентативный результат для установки ворот изображен на рисунке 1. Ворота одиночные ячейки, рисуя ворота вокруг линейной FSC-высоты против FSC-области фракции. Используйте неокрашенные фракции управления, чтобы нарисовать ворота для линии- фракции. Нарисуйте ворота для клеток CD34и далее характеризуйте этот подмножество, установив определенные ворота для клеток CD38- CD45RA. Загрузите 384 пластины скважины на машину FACS и сортируйте одиночные ячейки.ПРИМЕЧАНИЕ: Если это применимо к FACS-машина, переключитесь на возможность сохранить данные сортировки индексов, чтобы обеспечить повторную отслеживание отсортированных ячеек. Культивирование singly-sorted HSCs Непосредственно перенесите 384 пластины скважины в увлажненный инкубатор 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения испарения во время культуры, оберните 384 хорошо культуры пластины (с крышкой) в прозрачной полиэтиленовой пленкой. Держите 384 хорошо пластины в инкубаторе в течение 3-4 недель, пока видимые клоны появляются. Репрезентативные изображения клональной культуры изображены на рисунке 2. В зависимости от состояния входиного материала 5%-30% отсортированных клеток будут клонально расширяться. 4. Урожай hSPC клонов После 4 недель культивирования, определить, какие скважины имеют стоечность 30% или выше. Предварительно заполнить (для каждого клонального нароста) 1,5 мл микротрубок с 1 мл 1% BSA в PBS и пометить трубку в соответствии с соответствующим итогом. Предварительно влажный кончик пипетки с 1% BSA в PBS, чтобы свести к минимуму количество клеток, прилипающих к кончику пипетки. Pipet вверх / вниз среды в хорошо яростно (по крайней мере 5 раз) с 200 л пипетка (установленна на 75 Зл) и царапать дно колодца, чтобы ослабить клетки в колодце, и собирать клеточной подвески в помечены микротрубки, соответствующие хорошо. Возьмите 75 л свежего 1% BSA в PBS и повторить пипетки в колодце, чтобы обеспечить максимальное поглощение клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Клонально культивированные клетки могут прилипать к нижней части колодца. Осмотрите скважины с помощью стандартного перевернутого светового микроскопа, чтобы убедиться, что все клетки были собраны. Если все скважины с флюэнтивом в размере 30% были собраны, поместите 384 пластины скважины обратно в инкубатор. Клональные культуры могут размножаться до 5 недель. Спин вниз клеточной подвески в течение 5 мин на 350 х г. Должна быть видна небольшая гранулы. Тщательно удалите все, кроме 5 зл супернатанта. Клеточные гранулы могут быть заморожены при -20 градусов и храниться в течение нескольких месяцев до изоляции ДНК. 5. Изоляция ДНК Изолировать HSPC и MSC / T-клеточная ДНК с помощью микро-масштабного комплекта изоляции ДНК в соответствии с инструкцией производителя со следующими корректировками: Добавьте 2 ЗЛ RNase A после добавления буфера AL во время раздела 2. Инкубировать в течение 2 мин перед добавлением протеиназа K. Инкубировать в течение 30 минут при 56 градусах по Цельсию вместо 10 мин. Выясните ДНК, загрузив столбец с 50 зл буфера TE с низким EDTA (10 мм Tris, 0,1 мм EDTA). Для оптимального elution, перезагрузите eluate снова на колонке и закрутите снова. Определите концентрацию ДНК с помощью ДНК, измеряемых 2 Зл на клон. Урожайность ДНК обычно колеблется в зависимости от 0,5-3 нг/Л. 6. Секвенирование Выполните секвенирование ДНК, описанное Jager et al.13 7. Картирование и соматические мутации Карта вывода секвенирования (файлы FAST) к эталонного генома и вызов мутаций, как описано в Jager et al.13 Проверяйте данные на наличие аномальных кариотипических изменений в секвенированных клонах и массовых данных с помощью инструмента анализа номеров копий, такого как Control-FreeC14. До сих пор мы не сообщали о каких-либо HSPCs с кариотипическими аберрансами. Создайте черный список, который состоит из панели непревзойденных нормальных образцов для фильтрации целей из собственного набора образцов, как ранее описано13, или использовать следующий загруженный черный список: slt;https://data.mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3’gt. Фильтр одного нуклеотида вариации с помощью SNVFI злител;https://github.com/ToolsVanBox / SNVFI.gt;.gt; Предустановленный файл SNVFI.config, таким образом, что все пути к функциям помощника являются правильными. Выполнить SNVFI с файлом .ini, настроенным в соответствии с настройками, увиденными в дополнительном файле 1 (SNVFI.ini). Чтобы исключить in vitro индуцированные мутации, мы фильтруем для VAF 0,39. Проверьте вариант аллелева (VAF) выход SNVFI(Рисунок 4). Проверьте, является ли пик плотности участка около 0,5, указывая, что образец является клональным. ФАКТИВ: Чтобы определить часть генома, которая покрыта во время фильтрации, определить вызываемые регионы вдоль зародышевой линии и контролировать с помощью CallableLoci от GATK (Genome Analysis ToolKit):java-jar GenomeAnalysistK.jar-T CallableLoci-R reference.fasta-Я myreads.bam-Сводка таблицы.txt-o callable-status.bed ФАКТИВ: Извлеките Callable области из выхода CallableLoci и выполните парные пересечения между образцами и объемом с помощью скрипта Python CallableLoci-processor.py, присутствующих на https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Полученные файлы кровати могут быть использованы для дальнейшего фильтрации вывода SNVFI и для проверки мутационного профиля в разделе 9:CallableLoci-processor.py dir’in dir-out sample-name bulk-name -samples1 sample22 sample3 8. Индель Вызов Выберите все вставки и удаления (Indels) в файле raw-variants.vcf с помощью GATK SelectVariants:java -Xmx12G-jar GenomeAnalysistK.jar-T ВыборВарианты-R ссылка genome.fasta-V raw-variants.vcf-o raw-INDELs.vcf-выбратьТип ИНДЕЛЬ Список фильтров с использованием INDELFI lt;https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI;gt;:perl INDELFI.pl -i input.vcf (от шага 8.1)-s образец теста столбца-c образец управления столбом 9. Мутациальная проверка профиля Используйте полученные файлы .vcf из выхода SNVFI с шага 7.6 (или с шага 7.9 с дополнительным анализом локусов) для анализа геномного мутационного профиля, типов мутаций и анализа подписи с помощью R-пакета MutationalPatterns15: lt;http:/bioconductor.org/packages/release/bioc/html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html.html. Для репрезентативного вывода, который может быть произведен с помощью полученного файла .vcf, такого как мутационный спектр 96-тринуклеотид, см. Рисунок 5. 10. Строительство девирационного линейного дерева с использованием базовых замен Чтобы построить дерево линии развития, обнаружить общие мутации между клонами. Мутации, присутствующие в первых ветвях линейного дерева, также могут быть подклонально представлены в массовом образце (MSC/T-cells). Позже ветвления линий будут определяться мутациями, разделяемыми только клонами HSPC. Для выявления мутаций, которые присутствуют в подмножестве клонов и подклонически присутствуют в объеме, выполните следующие шаги. Для фильтрации соматических мутаций, разделяемых между клонами, запустите filterSomatic.py скрипт в терминале на основе Unix. Скрипт можно найти по адресу https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Перед запуском этого скрипта отредкийте файл filterSomatic.ini (см. Дополнительный файл2), чтобы установить пути и настроить другие параметры. Выполнить filterSomatic.py(python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini). Фильтр для мутаций, которые покорно присутствуют в объеме с помощью Determine-lowVAF-bulk. R-скрипт в терминале на основе Unix. Скрипт можно найти по адресу https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Это позволит генерировать отдельные файлы .vcf для общих и уникальных SNVs:Rscript Determine-lowVAF-bulk. R–vcf Путь/К/Фильтру-соматике-output.vcf–бык навалом-имя–образец-имя образца–гендерная ФЗ–аут-дир-аут-дир Определите все мутации, разделяемые между клонами, которые не присутствуют в массовой выборке, перекрывая все позиции мутаций (конкатная колонка 1 и 2 выхода SNVFI). Исключить ложные срабатывания, полученные во время шагов 10.5 и 10.6 при ручном осмотре с использованием IGV16. Мутации считаются ложными, когда нет, когда мутация присутствует в зародышевой линии или когда присутствует в плохо отображенные регионы, см. Рисунок 7.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем повторно секвенировать все общие локусы независимо, используя целевое или секвенирование. Используйте общие мутации, полученные во время шагов 10.1 и 10.2, чтобы построить двоичную таблицу мутаций по сравнению с секвенированными клонами, с 0, указывающими на отсутствие мутации, и 1, указывающим на наличие мутации. Выход мутации двоичной таблицы, как в тепловой карте вместе с дендрограммой с указанием отношений линии между клетками с помощью R. Тепловая карта указывает состояние мутаций для каждой клетки. Смотрите выход этой функции(рисунок 6).         Клоны злт;- read.table (“Путь/К/Двоичный”)         моя палитра йlt;- colorRampPalette (c (“#cccccc”, “#333333”))(n no 2)колебрейки Злт;- c (0,0.5,1)         heatmap.2 (клоны, distfun’function (x) dist (x,method и ‘binary’),hclustfun’function (x) hclust (x,method – средний),дендрограмма – “колонка”, Роув и Ф,col’my-palette, брейки-коло-брейки,трассы “никто”, плотности.инфо “никто”)