Karakteriseren van Mutationele belasting en klonale samenstelling van menselijk bloed

Monsters moeten worden verkregen in overeenstemming met de juiste ethische protocollen en donoren moeten voorafgaand aan de procedure geïnformeerde toestemming geven. 1. bereiding van het monster materiaal Opmerking: Bij het werken met vers verkregen materiaal, begin met stap 1,1. Bij het werken met bevroren materiaal begint u met stap 1,2. Voorbereiding van vers beenmerg, snoer bloed of perifeer bloed Isoleer de mononucleaire Fractie van het monster met behulp van scheiding van dichtheidsgradiënt door de instructies van de fabrikant te volgen (Zie tabel met materialen) en Tel de mononucleaire cellen met behulp van een hemocytometer. Na isolatie van de mononucleaire cellen gaat u verder met stap 1,3. Optioneel: het aanbevolen aantal cellen dat nodig is om een volledige 384 goed plaat van Hspc’s te sorteren is 1 – 2 x 107. Als meer cellen zijn geïsoleerd tijdens het centrifugeren van dichtheidsgradiënt, bewaar het overtollige cellen in vloeibare stikstof. Respendeer cellen in 500 μL IMDM + 10% FBS per 1 x 107 cellen, en voeg drop-by-drop toe een gelijk volume imdm + 30% FBS + 20% DMSO om een suspensie van 1 x 107 cellen te bereiken in 1 ml IMDM + 20% FBS + 10% DMSO. Breng de mononucleaire cellen onmiddellijk over naar 1 mL cryogene flesjes en vriescellen bij-80 °C in een cel met gecontroleerde snelheid die ‘s nachts bevriest. Breng de cellen de volgende dag over naar een vloeibare stikstof opslag bij verdere verwerking. Het klaarmaken van bevroren mononucleaire cellen uit het beenmerg, bloed snoer of perifeer bloed Bereid 50 mL celontdooien met 45 mL van Iscove gemodificeerd Eagle’s medium (IMDM) en 5 mL foetaal runderserum (FBS) en warm in een waterbad van 37 °C. Neem de injectieflacon met het monster uit de opslag van vloeibare stikstof, breng het monster over naar droogijs en ontdooit zo snel mogelijk in een waterbad van 37 °C. Wanneer het monster bijna ontdooid is, veeg de injectieflacon dan met 70% ethanol en breng de inhoud over in een conische buis van 50 mL. Spoel de injectieflacon af met 1 ml voorverwarmde imdm + 10% FBS om de resterende cellen te verzamelen en voeg deze oplossing druppelsgewijs (5 s per druppel) toe aan het ontdooide monster terwijl de buis zachtjes wordt gezwenpt. Voeg een extra voorverwarmde 15 ml imdm + 10% FBS druppelsgewijs toe aan het monster terwijl de buis zachtjes wordt gezwenpt. Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min bij 350 x g. Verwijder alles maar ± 3 mL van het supernatant. Rebreng de cellen in de overgebleven supernatant en Verdun door 20 mL IMDM + 10% FBS drop-by-drop toe te voegen terwijl de buis zachtjes wordt geschud. Neem 10 μL celsuspensie voor het tellen van cellen. Verdun deze 10 μL door 20 μL 0,4% trypeen blauwe oplossing toe te voegen en de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer. Het celnummer kan afnemen bij ontdooien, met tot 50% celverlies na ontdooien. De levensvatbaarheid van de cellen moet tussen 70% en 90% liggen. Als u werkt met bloedcellen van het beenmerg of de navelstreng, neem dan 5 x 106 mononucleaire cellen in voor MSC-cultuur (stap 2,1). Bij het werken met perifeer bloed, nemen 2 – 5 x 106 cellen voor T-cel isolatie (stap 2,2) Pellet overgebleven cellen 5 min bij 350 x g en respenderen in 3 ml FACS buffer (0,05% BSA + 1 mm EDTA in PBS). Breng 1 x 105 cellen over naar een microtube gevuld met 200 ΜL FACS buffer, die zal dienen als een negatieve controle voor Flowcytometrie (stap 3,8), en blijf op ijs. 2. celcultuur Opmerking: Om catalogi van somatisch verworven mutaties te verkrijgen, moet de donor-specifieke kiembaan variatie worden uitgefilterd. Wanneer u begint met beenmerg biopsieën of navelstreng bloed, kunnen mesenchymale stromale cellen (MSCS) worden gebruikt als afgestemde controle om te filteren op kiembaan variatie. In dit geval volgt u paragraaf 2,1. Bij gebruik van (gemobiliseerd) perifeer bloed volgt u stap 2,2 om T-cellen te isoleren en te gebruiken als overeenkomend controlemonster om te filteren op kiembaan variatie (Figuur 1). De bulk T-Cell populatie zal dezelfde Lineage relatie als Hspc’s delen. MSC Culture Bereid 50 mL MSC medium met 45 mL DMEM/F12 medium, 10% FBS, 500 μL trypsine of trypsine Alternative, en 500 μL penicillaire/streptomycine oplossing. Plaat ongeveer 5 x 105 mononucleaire cellen in 1,5 ml MSC medium per put. Plaats de cellen in een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium na 24 h, en vervolgens vervangen medium elke 3 dagen om ervoor te zorgen dat alle hematopoietische cellen worden weggespoeld. Ga verder naar cultuur tot de confluentie 100% is. Als de MSCs Confluent zijn, wassen cellen met 1 mL PBS en oogst de MSCs door toevoeging van 200 μL trypsine of trypsine alternatief per put. Incuberen cellen gedurende 5 min bij 37 °C. Voeg 800 μL MSC-medium toe en Pipet de cellen omhoog en omlaag om cellen los te maken van de goed plaat. Breng MSCs over naar de microcentrifuge buis en pellet de cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 350 x g. Verwijder het supernatant en ga door met DNA-isolatie of bewaar de pellet bij-20 °C voor latere DNA-isolatie (rubriek 4). T-cel isolatieOpmerking: Bij gebruik van (gemobiliseerd) perifeer bloed kunnen T-cellen worden geïsoleerd en gebruikt als kiembaan-controle. Respendeer de celpellet in 100 μL anti-CD3 kleurings oplossing (1:100 verdunning van anti-CD antilichaam in FACS buffer). Was de cellen door 1 mL FACS buffer toe te voegen. Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min bij 350 x g en respenderen in 300 ΜL FACS buffer. Isoleer ten minste 5 x 105 CD3 + cellen met behulp van een FACS-sorteerder in een 5 ml polystyreen buis die vooraf is gevuld met 1 ml FBS. Pellet de gesorteerde cellen met centrifugeren gedurende 5 minuten bij 350 x g, verwijder het supernatant en ga direct verder met DNA-isolatie (rubriek 4) of bewaar de pellet bij-20 °c voor latere DNA-isolatie. 3. HSPC isolatie, sortering en cultuur Spin naar beneden bij 1 – 2 x 107 mononucleaire cellen gedurende 5 minuten bij 350 x g en reanimatie in 50 ΜL van de FACS buffer (zie stap 2.2.1). Breng de cellen over naar een micro centrifugebuis.Opmerking: Bij het sorteren met > 2 x 107 cellen, verhogen de antilichaammix en FACS buffer volumes dienovereenkomstig. Bereid 50 μL van 2x HSC kleurenmix volgens het recept in tabel 1. Antilichaam volume [μL] BV421-CD34 5 FITC-Lineage mix (CD3/14/19/20/56) 5 PE-CD38 2 APC-CD90 0,5 PerCP/CY 5.5-CD45RA 5 PE/Cy7-CD49f 1 FITC-CD16 1 FITC-CD11 5 FACS-buffer 25,5 Tabel 1: HSC Sorteer combinatie. Weergegeven is een tabel met de verdunningen van antilichamen die worden gebruikt om de HSCs te sorteren. Meng 50 μL celoplossing met de bereide HSC-kleurenmix en inincuberen de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) of 1 uur op ijs voor de antilichamen die binden. Was de cellen door 1 mL FACS buffer en pellet toe te voegen door 5 min centrifugeren bij 350 x g. Respendeer de cellen in 300 μL FACS buffer en filtreer de celsuspensie door een 35 μm cel met zeef-afgetopte 5 mL polystyreen buis om celklonten te verwijderen vóór fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Bereid 25 mL HSPC kweekmedium, bestaande uit 1x SFEM medium aangevuld met 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, en 100 ng/mL antibioticum formulering (Zie tabel van de materialen). Vul een 384 well Cell Culture Plate met 75 μL HSPC kweekmedium in elke put.Opmerking: Om verdamping van het medium in de buitenste putten te voorkomen, vult u de buitenste putjes met 75 μL steriel water of PBS en gebruikt u deze putten niet voor het sorteren van cellen. Sorteren van enkele Hspc’s Stel de poorten in voor de HSPC-sortering op basis van een onbevlekt besturingselement (stap 1,9) en 10.000 cellen uit het bevlekt monster. Een representatief resultaat voor het instellen van poorten is afgebeeld in Figuur 1. Poort enkele cellen door het tekenen van een hek rond de lineaire FSC-hoogte versus FSC-gebied Fractie. Gebruik de Onbevlekte controle Fractie om de poort voor de Lineage- fractie te tekenen. Teken poorten voor CD34+ cellen en karakteriseren deze subset verder door een specifieke poort voor CD38- CD45RA- cellen in te stellen. Laad de 384 well plate op de FACS machine en sorteer enkele cellen.Opmerking: Indien van toepassing op de FACS-machine, schakelt u de optie in om index sorteer gegevens te behouden zodat de gesorteerde cellen opnieuw kunnen worden getraceerd. Culturing afzonderlijk gesorteerde HSCs Breng de 384 well plate direct over naar een bevoficeerde 37 °C incubator met 5% CO2.Opmerking: Om verdamping tijdens de kweek te voorkomen, wikkel de 384 well Culture Plate (met deksel) in transparante polyethyleen wrap. Houd de 384 goed in de incubator voor een 3 – 4 weken totdat er zichtbare klonen verschijnen. Representatieve beelden van de klonale cultuur worden afgebeeld in Figuur 2. Op basis van de conditie van het ingangs materiaal zal 5% – 30% van gesorteerde cellen klonen. 4. het oogsten van HSPC-klonen Na 4 weken van culturing, bepalen welke putten hebben een confluentie van 30% of hoger. Pre-Fill (voor elke klonale uitgroei) 1,5 mL microbuisjes met 1 mL 1% BSA in PBS en label de buis volgens de corresponderende put. Bevochtig een pipetpunt vooraf met 1% BSA in PBS om het aantal cellen dat aan de pipetpunt blijft kleven te minimaliseren. Pipetteer het medium in het fel (minstens 5 keer) met een pipet van 200 μL (ingesteld op 75 μL) en schrael de bodem van de put om cellen in de put los te maken en de celsuspensie in de gelabelde micro buis te verzamelen die overeenkomt met de put. Neem 75 μL verse 1% BSA in PBS en herhaal pipetteren in de put om de maximale opname van cellen te garanderen.Opmerking: Clonally gekweekte cellen kunnen vasthouden aan de bodem van goed. Inspecteer de putten met behulp van een standaard omgekeerde lichtmicroscoop om te controleren of alle cellen zijn verzameld. Als alle putten met > 30% confluentie zijn geoogst, plaats de 384 goed plaat terug in de incubator. Klonale culturen kunnen zich tot 5 weken vermenigvuldigen. Draai de celsuspensie gedurende 5 minuten op 350 x g. Een kleine pellet moet zichtbaar zijn. Verwijder voorzichtig alle, maar ongeveer 5 μL supernatant. Celpellets kunnen worden bevroren bij-20 °C en gedurende meerdere maanden vóór de DNA-isolatie worden bewaard. 5. DNA-isolatie Isoleer HSPC en MSC/T-Cell DNA met behulp van een micro-schaal DNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant met de volgende aanpassingen: Voeg 2 μL RNase A toe na toevoeging van buffer AL tijdens rubriek 2. Inincuberen gedurende 2 minuten voordat proteïinase K wordt toegevoegd. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 56 °C in plaats van 10 min. Elute het DNA door het laden van de kolom met 50 μL TE buffer met lage EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). Voor een optimale elutie laadt u het eluaat opnieuw op de kolom en draait u opnieuw. Bepaal de DNA-concentratie met een DNA van 2 μL per kloon. De DNA-opbrengst varieert meestal tussen 0,5 – 3 ng/μL. 6. sequentiëren Voer DNA-sequencing uit zoals beschreven door jager et al.13 7. Mapping en somatische mutatie bellen Wijs de uitvoer van sequentiëren (FASTQ-bestanden) toe aan het referentie-genoom en noem mutaties zoals beschreven in jager et al.13 Inspecteer de gegevens op afwijkende karyotypische wijzigingen in gesequentieerde kloon-en bulkgegevens met behulp van een Kopieer nummeranalyse tool, zoals Control-FreeC14. Tot nu hebben we geen Hspc’s met karyotypic aberrances gerapporteerd. Genereer een zwarte lijst, die bestaat uit een panel van ongeëvenaarde normale monsters voor filter doeleinden uit een eigen set van monsters, zoals eerder beschreven13, of gebruik de volgende geüploade blacklist: . Filter enkele nucleotide variaties met behulp van SNVFI . Vooraf ingesteld SNVFI. config-bestand, zodat alle paden naar helper-functies correct zijn. Voer SNVFI uit met het. ini-bestand dat is geconfigureerd volgens de instellingen in aanvullend bestand 1 (snvfi. ini). Om in vitro geïnduceerde mutaties uit te sluiten, filteren we op een VAF ≥ 0,39. Controleer de variant allel-breuk (VAF)-uitgang van SNVFI (Figuur 4). Controleer of de piek van het dichtheids perceel in de buurt van 0,5 is, wat aangeeft dat het monster klonale is. Optioneel: Om het deel van het genoom te bepalen dat tijdens het filteren wordt bedekt, bepaalt u de te bepalen regio’s langs kiembaan en Control met behulp van callableloci van gatk (genoom Analysis Toolkit):java-jar GenomeAnalysisTK. jar \-T CallableLoci \-R referentie. fasta \-I mylees. BAM \-overzicht Table. txt \-o callable_status. bed Optioneel: Haal de te callableloci-uitvoerbare regio’s op en voer Pairwise kruispunten uit tussen de voorbeelden en de bulk met behulp van het python-script CallableLoci_processor. py aanwezig op https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . De resulterende bedbestanden kunnen worden gebruikt om de uitvoer van SNVFI verder te filteren en om het mutationele profiel in sectie 9 te inspecteren:CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – samples sample1 sample2 sample3 8. Indel bellen Selecteer alle inserties en verwijderingen (indels) in het bestand raw_variants. vcf met behulp van GATK Selectvarianten:Java-Xmx12G \-jar GenomeAnalysisTK. jar \-T Selectvarianten \-R reference_genome. fasta \-V raw_variants. vcf \-o raw_INDELs. vcf \-selectType INDEL Filter raw_INDELS. vcf lijst met behulp van INDELFI :perl INDELFI.pl-i input. vcf (vanaf stap 8,1) \-s kolom test sample \-c kolom controlemonster 9. inspectie van het mutational profiel Gebruik de resulterende. vcf-bestanden van snvfi-uitvoer van stap 7,6 (of van stap 7,9 met optionele Callable loci-analyse) voor het analyseren van het genomische mutatie profiel, mutatie typen en handtekening analyse met behulp van het R-pakket mutationalpatterns15: Voor representatieve uitvoer die kan worden geproduceerd met het resulterende. VCF-bestand, zoals een 96-trinucleotide-mutationspectrum, Zie Figuur 5. 10. bouw van een ontwikkelings afstamming met behulp van basis vervangingen Om een ontwikkelings afstamming te construeren, detecteert u gedeelde mutaties tussen klonen. Mutaties die aanwezig zijn in de eerste takken van de Lineage tree kunnen ook subclonaal aanwezig zijn in het bulk monster (MSCs/T-cellen). Latere vertakkings lijnen zullen worden gedefinieerd door mutaties die alleen door HSPC-klonen worden gedeeld. Voer de volgende stappen uit om mutaties te identificeren die aanwezig zijn in een subset van de klonen en subclonaal aanwezig zijn in de bulk. Om te filteren op somatische mutaties die worden gedeeld tussen klonen, voert u het script filterSomatic.py uit in een op UNIX gebaseerde terminal. Het script kan worden gevonden op https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Voordat u dit script uitvoert, bewerkt u het bestand filterSomatic. ini (Zie aanvullend bestand 2) om de paden in te stellen en de andere parameters aan te passen. Voer filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i filterSomatic. ini). Filter op mutaties die subclonaal aanwezig zijn in de bulk met behulp van de Determine_lowVAF_bulk. R-script in een op UNIX gebaseerde terminal. Het script kan worden gevonden op https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Hierdoor worden afzonderlijke vcf-bestanden gegenereerd voor gedeelde en unieke Snv’s:Rscript Determine_lowVAF_bulk. R–VCF pad/naar/Filter_somatic_output. vcf–bulk bulk_name–sample_name sample-naam–geslacht [M | F–out_dir out_dir Bepaal alle mutaties die worden gedeeld tussen klonen die niet aanwezig zijn in het bulk monster door alle mutatie posities te overlappen (aaneenschakeling van kolom 1 en 2 van SNVFI-uitvoer). Uitsluiten van valse positieven verkregen tijdens de stappen 10,5 en 10,6 door handmatige inspectie met behulp van IGV16. Mutaties worden als vals beschouwd wanneer ze niet aanwezig zijn, wanneer de mutatie aanwezig is in de kiembaan of indien aanwezig in slecht toegewezen gebieden, Zie Figuur 7.Opmerking: We raden ten zeerste aan om alle gedeelde loci onafhankelijk van elkaar te sequentiëren met behulp van gerichte of Sanger–sequencing. Gebruik de gedeelde mutaties verkregen tijdens de stappen 10,1 en 10,2 om een binaire tabel van mutaties versus gesequentieerde klonen te bouwen, waarbij 0 aangeeft dat de mutatie niet aanwezig is en 1 de aanwezigheid van de mutatie aangeeft. Uitvoer de mutatie binaire tabel zoals in een heatmap samen met een dendrogram dat de Lineage relaties tussen cellen met behulp van R aangeeft. De heatmap geeft de mutatie status voor elke cel aan. Zie de uitvoer van deze functie (Figuur 6).         Klonen <-lezen. table ("pad/naar/BinaryTable")         my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)col_breaks <-c (0, 0,5, 1)         heatmap. 2 (klonen, distfun = functie (x) dist (x, method = ‘ binary ‘),hclustfun = functie (x) hclust (x, methode = gemiddelde),Dendrogram = “kolom”, Rowv = F,Col = my_palette, Breaks = col_breaks,Trace = “none”, dichtheid. info = “geen”)