VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben
Summary
Hier stellen wir VirWaTest vor, eine einfache, erschwingliche und tragbare Methode zur Konzentration und Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort.
Abstract
Viren, die von Menschen und Tieren ausgeschieden werden, können Wasserquellen kontaminieren und eine Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen, wenn dieses Wasser zum Trinken, zur Bewässerung von Lebensmitteln, zum Waschen usw. verwendet wird. Der klassische Fäkalbakterienindikator überprüft nicht immer das Vorhandensein viraler Krankheitserreger, so dass der Nachweis viraler Krankheitserreger und Viralindikatoren relevant ist, um Maßnahmen zur Risikominderung zu ergreifen, insbesondere in humanitären Szenarien und in Gebieten. wo wasserübertragene Virusausbrüche häufig auftreten.
Derzeit stehen mehrere kommerzielle Tests zur Quantifizierung von Fäkalindikatorbakterien (FIB) zur Prüfung am Einsatzort zur Verfügung. Solche kommerziellen Tests sind jedoch nicht für den Nachweis von Viren verfügbar. Der Nachweis von Viren in Umweltwasserproben erfordert die Konzentration mehrerer Liter auf kleinere Volumina. Darüber hinaus beruht der Nachweis von Viren, sobald es konzentriert ist, auf Methoden wie nukleinsäureextraktion und molekularer Detektion (z. B. Polymerase-Kettenreaktion [PCR]-basierte Assays) der viralen Genome.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Konzentration von Viren aus 10 L Wasserproben sowie die Extraktion von viralen Nukleinsäuren am Einsatzort mit einfachen und tragbaren Geräten. Dies ermöglicht die Prüfung von Wasserproben am Einsatzort für mehrere Viren und ist in humanitären Szenarien sowie in jedem Kontext nützlich, in dem kein ausgestattetes Labor zur Verfügung steht. Alternativ ermöglicht die Methode die Konzentration von Viren in Wasserproben und den Versand des Konzentrats an ein Labor bei Raumtemperatur zur weiteren Analyse.
Introduction
In den ersten Phasen humanitärer Notfälle sind der Zugang zu sauberer Wasserversorgung, sanitären Einrichtungen und Hygiene für das Überleben der Betroffenen von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Überwachung der Wasserqualität eine Priorität, um Ausbrüche auf dem Wasser zu verhindern. Es ist allgemein bekannt, dass kontaminiertes Wasser häufig der Ursprung von Krankheiten ist, aber es ist oft schwierig, die Quellen von Virusausbrüchen wie dem Hepatitis-E-Virus (HEV) zu bestimmen, selbst wenn herkömmliche Labormethoden zur Verfügung stehen. Die Kontrolle der Wasserqualität basiert auf der Quantifizierung von FIB1,2,3,4. Es wurde jedoch ausführlich dokumentiert, dass es keinen Zusammenhang zwischen dem Fehlen von FIB und dem Vorhandensein von viralen, wasserübertragenen Krankheitserregern wie Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) oder HEV5,6gibt. Daher kann die Verwendung der auf FIB basierenden Wasserqualitätskriterien zu einer Unterschätzung der Risiken führen, die mit dem Vorhandensein von wasserbasierten Viruserregern verbunden sind. Die Überwachung von Indikatorviren wie humanen Adenoviren (HAdV) oder spezifischen Krankheitserregern wäre hilfreich bei der Definition der Exposition gegenüber virusviralen Krankheitserregern und der Identifizierung der potenziellen Quelle einer infektion beim Menschen7,8, 9,10 und bei der Validierung der Wirksamkeit von sanitären Maßnahmen11.
Bisher beruhte der Nachweis von Viren in diesen Szenarien auf qualifiziertes Personal und komplexe Logistik. VirWaTest (virwatest.org) zielt auf die Entwicklung einer einfachen, erschwinglichen und tragbaren Methode zur Konzentration und anschließenden Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort ab.
Die Viruskonzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung von 10 L Wasserproben, durch die Viren in kleineren Bänden12,13zurückgewonnen werden. Die Flocken werden gesammelt und einem Puffer hinzugefügt, der die Viren liert und verhindert, dass die Nukleinsäuren abgebaut werden, wenn sie nicht mehr als 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
Die Nukleinsäureextraktionsmethode basiert auf der Verwendung von magnetischen Partikeln, an die die Nukleinsäuren adsorbiert werden. Sie können mit einer magnetischen Pipette, an die sich die Partikel anheften, von einem Waschpuffer in einen anderen und schließlich in den Elutionspuffer übertragen werden. Die erhaltenen viralen Nukleinsäuresuspensionen können an ein Referenzlabor geliefert werden, wo der Nachweis mit molekularen Methoden auf PCR-Basis durchgeführt werden kann. Für jede Nukleinsäureextraktion werden zwei verschiedene Mengen getestet, um eine enzymatische Hemmung, die von der Probe ausgeht, auszuschließen. Alternativ können bei minimaler Geräteverfügbarkeit PCR-Tests am Einsatzort durchgeführt werden. Der gesamte Prozess ist so konzipiert, dass er unabhängig von einem Netzteil durchgeführt wird (Abbildung 1).
Ein quantitativer PCR-Test zum Nachweis von HAdV, der vom Menschen ausgeschieden und in Abwasserproben in hohen Konzentrationen gefunden wurde, wurde angepasst, um am Einsatzort ausgeführt zu werden. HAdV werden als menschliche fäkalvirale Indikatoren verwendet. Eine PCR zur Quantifizierung von MS2-Bakteriophagen wurde ebenfalls angepasst, da MS2 in VirWaTest als Prozesskontrolle eingesetzt wird. Die Methode kann für die Erkennung von Viren von Interesse angepasst werden.
Nach der Entwicklung wurde die VirWaTest-Methode von den Anwendern in zwei verschiedenen Einstellungen in der Republik Zentralafrika (RCA) und Ecuador angewendet und gibt Feedback zur Anwendung des Protokolls in realen Situationen.
Unserer Kenntnis nach ist dies das erste Verfahren, das die Konzentration und Detektion von Viren am Einsatzort ermöglicht, unabhängig von stromversorgung, großen Geräten und Gefrier-/Kühlbedingungen. Es wird empfohlen, zwei Wiederholungen jeder Wasserprobe zu sammeln, um robuste Ergebnisse zu erzielen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die VirWaTest-Methode ermöglicht die Konzentration von Viren und Nukleinsäureextraktion aus Wasserproben am Einsatzort von unerfahrenen Anwendern. Es ist ein erschwingliches, schnelles und einfaches Protokoll. Die Konzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung mit Magermilch, wodurch sich Magermilchproteine aufgrund des niedrigen pH- und hohen Leitfähigkeitswertes zu Flocken aggregieren lassen, die die Viren adsorbieren. Wenn die Flocken Sediment, ist es einfach, sie zu sammeln, so dass es möglich ist…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest war ein Forschungsprojekt, das vom HIF (Humanitarian Innovation Funds) Programm der ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance) finanziert wurde. Die Autoren würdigen die WASH-Teams, die freundlicherweise an dieser Studie mitgearbeitet haben. Die Analyse von Proben in Ecuador wurde von Oxfam Ecuador und Direccién de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas ist Serra-Hunter Fellow an der Universität Barcelona.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
Riferimenti
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