VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters
Summary
Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.
Abstract
Virussen die door mensen en dieren worden uitgescheiden, kunnen waterbronnen besmetten en een risico vormen voor de menselijke gezondheid wanneer dit water wordt gebruikt voor het drinken, voedsel irrigatie, wassen, enz. De klassieke fecale bacterie indicator controleert niet altijd op de aanwezigheid van virale pathogenen, dus de opsporing van virale pathogenen en virale indicatoren is relevant om maatregelen van risicobeperking vast te stellen, met name in humanitaire scenario’s en in gebieden waar door water overgedragen virale uitbraken frequent zijn.
Op dit moment zijn er verschillende commerciële tests beschikbaar die de kwantificering van fecale indicator bacteriën (FIB) mogelijk maken om te testen op het punt van gebruik. Dergelijke commerciële tests zijn echter niet beschikbaar voor de opsporing van virussen. Voor de opsporing van virussen in milieuwater monsters moet een aantal liters in kleinere volumes worden geconcentreerd. Bovendien vertrouwt de opsporing van virussen eenmaal geconcentreerd op methoden zoals nucleïnezuur extractie en moleculaire detectie (bijv. polymerase-kettingreactie [PCR]-gebaseerde assays) van de virale Genomes.
De hier beschreven methode maakt de concentratie van virussen uit 10 L watermonsters, evenals de extractie van virale nucleïnezuren op het punt van gebruik, met eenvoudige en draagbare apparatuur. Dit maakt het testen van watermonsters op het punt van gebruik voor verschillende virussen mogelijk en is nuttig in humanitaire scenario’s, evenals in elke context waarin een uitgerust laboratorium niet beschikbaar is. Als alternatief kan de methode het concentreren van virussen aanwezig zijn in watermonsters en de verzending van het concentraat naar een laboratorium bij kamertemperatuur voor verdere analyse.
Introduction
In de eerste fasen van humanitaire noodsituaties zijn de toegang tot schoon water, sanitaire voorzieningen en hygiëne van cruciaal belang voor het voortbestaan van de betrokkenen. Daarom is het bewaken van de waterkwaliteit een prioriteit om uitbraken van water te voorkomen. Het is bekend dat verontreinigd water vaak de oorsprong van ziekten is, maar het is vaak moeilijk om de bronnen van virale uitbraken zoals het hepatitis E-virus (HEV) te bepalen, zelfs met de beschikbaarheid van conventionele laboratoriummethoden. De controle van de waterkwaliteit is gebaseerd op de kwantificering van FIB1,2,3,4. Er is echter uitgebreid gedocumenteerd dat er geen correlatie is tussen de afwezigheid van FIB en de aanwezigheid van virale watergedragen pathogenen zoals Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) of HEV5,6. Het gebruik van de water kwaliteitscriteria op basis van FIB kan dus leiden tot een onderschatting van de Risico’s die verbonden zijn aan de aanwezigheid van watergedragen virale pathogenen. De surveillance van indicator virussen, zoals humane adenovirussen (hadv), of specifieke pathogenen zou nuttig zijn bij het bepalen van de blootstelling aan virale pathogenen en het identificeren van de potentiële bron van menselijke infectie7,8, 9,10 en bij de validering van de werkzaamheid van sanitaire maatregelen11.
Tot nu toe waren de opsporing van virussen in deze scenario’s gebaseerd op vakkundig personeel en complexe logistiek. VirWaTest (virwatest.org) is gericht op de ontwikkeling van een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode voor de concentratie en de daaropvolgende opsporing van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.
De virusconcentratie is gebaseerd op het principe van biologische flocculatie van 10 L watermonsters, waardoor virussen worden teruggewonnen in kleinere volumes12,13. De vlokken worden verzameld en toegevoegd aan een buffer die de virussen lyseert en voorkomt de nucleïnezuren van afbraak wanneer ze bewaard bij kamertemperatuur gedurende niet meer dan 2 weken.
De nucleïnezuur extractiemethode is gebaseerd op het gebruik van magnetische deeltjes waaraan de nucleïnezuren worden geadsorreven. Ze kunnen worden overgebracht van de ene spoel buffer naar de andere en uiteindelijk in de elutie buffer met behulp van een magnetische pipet waaraan de deeltjes hechten. Viraal nucleïnezuur suspensies verkregen kunnen worden verzonden naar een referentielaboratorium waar de detectie kan worden uitgevoerd met behulp van moleculaire methoden op basis van PCR. Voor elke extractie van nucleïnezuur worden twee verschillende hoeveelheden getest om enzymatische remming uit te voeren, ontstaan door het monster. Als alternatief, met minimale beschikbaarheid van apparatuur, kunnen PCR-tests worden uitgevoerd op het punt van gebruik. Het gehele proces is ontworpen om onafhankelijk van een stroomtoevoer te worden uitgevoerd (Figuur 1).
Een kwantitatieve PCR-test voor het opsporen van HAdV, uitgescheiden door de mens en gevonden in afvalwater monsters in hoge concentraties, is aangepast om te worden uitgevoerd op het punt van gebruik. HAdV worden gebruikt als menselijke fecale virale indicatoren. Een PCR voor de kwantificering van ms2 bacteriofaag is ook aangepast sinds ms2 wordt gebruikt in virwatest als procesbeheersing. De methode kan worden aangepast voor de opsporing van een virus van belang.
Na de ontwikkeling, de VirWaTest methode is toegepast door de gebruikers in twee verschillende instellingen in de Republiek van Centraal-Afrika (RCA) en Ecuador, het verstrekken van feedback over de toepassing van het protocol in reële situaties.
Voor onze kennis is dit de eerste procedure die de concentratie en opsporing van virussen op het punt van gebruik mogelijk maakt, onafhankelijk van elke voeding, grote apparatuur en Vries-/koelingcondities. Het wordt aanbevolen om twee replicaten van elk watermonster te verzamelen om robuuste resultaten te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De VirWaTest methode maakt de concentratie van virussen en nucleïnezuur extractie van watermonsters op het punt van gebruik door niet-ervaren gebruikers. Het is een betaalbaar, snel en eenvoudig protocol. De concentratie is gebaseerd op het principe van organische flocculatie met behulp van magere melk, waarbij de lage pH-en hoge geleidbaarheids condities het gebruik van magere melkeiwitten in vlokken tot de virussen maken. Wanneer de vlokken sediment, het is gemakkelijk om ze te verzamelen, waardoor het mogelijk om te …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest was een onderzoeksproject gefinancierd door het HIF (humanitair innovatiefonds) programma van ELHRA (het verbeteren van leren & onderzoek voor humanitaire hulp). De auteurs erkennen de WASTEAMS die vriendelijk in deze studie hebben samengewerkt. De analyse van samples in Ecuador werd gefinancierd door Oxfam Ecuador en Dirección de Recheran de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas is een Serra-Hunter Fellow aan de Universiteit van Barcelona.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
Riferimenti
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
