VirWaTest, пункт использования метод для обнаружения вирусов в образцах воды
Summary
Здесь мы представляем VirWaTest, который является простым, доступным и портативным методом для концентрации и обнаружения вирусов из образцов воды в точке использования.
Abstract
Вирусы, выделяемые людьми и животными, могут загрязнять источники воды и представлять опасность для здоровья человека, когда эта вода используется для питья, орошения пищевых продуктов, мытья и т.д. Классический индикатор фекальных бактерий не всегда проверяет наличие вирусных патогенов, поэтому обнаружение вирусных патогенов и вирусных показателей имеет отношение к принятию мер по снижению риска, особенно в гуманитарных сценариях и в районах где часто происходят вспышки вирусной инфекции, передаваемой через воду.
В настоящее время для тестирования в точке использования доступно несколько коммерческих тестов, позволяющих количественно определить бактерии фекальных индикаторов (FIB). Однако такие коммерческие тесты недоступны для обнаружения вирусов. Обнаружение вирусов в пробах воды в окружающей среде требует концентрации нескольких литров в меньших объемах. Кроме того, после сосредоточения, обнаружение вирусов опирается на такие методы, как добыча нуклеиновой кислоты и молекулярное обнаружение (например, полимераза цепной реакции (PCR основе анализов) вирусных геномов.
Описанный здесь метод позволяет концентрацию вирусов из 10 L проб воды, а также извлечение вирусных нуклеиновых кислот в точке использования, с простым и портативным оборудованием. Это позволяет проводить тестирование проб воды в точке применения нескольких вирусов и полезно в гуманитарных сценариях, а также в любом контексте, где не имеется оборудованной лаборатории. Кроме того, метод позволяет концентрировать вирусы, присутствующие в пробах воды, и отгружать концентрат в лабораторию при комнатной температуре для дальнейшего анализа.
Introduction
На первых этапах любой чрезвычайной гуманитарной помощи доступ к чистой воде, санитарии и гигиене имеет решающее значение для выживания пострадавших. Поэтому мониторинг качества воды является приоритетной задачей для предотвращения вспышек воды. Хорошо известно, что загрязненная вода часто является источником заболеваний, но часто бывает трудно определить источники вирусных вспышек, таких как вирус гепатита Е (HEV), даже при наличии обычных лабораторных методов. Контроль качества воды основан на количественной оценкеFIB 1, 2,3,4. Тем не менее, было широко документировано, что нет никакой корреляции между отсутствием FIB и наличие вирусных патогенов, передающихся через воду, таких как ротавирус (RoV), норовирус (NoV), или HEV5,6. Таким образом, использование критериев качества воды, основанных на FIB, может привести к недооценке рисков, связанных с наличием вирусных патогенов, передающихся через воду. Наблюдение за вирусами индикаторов, такими как аденовирусы человека (HAdV), или конкретные патогенные микроорганизмы будут полезны в определении воздействия вирусных патогенов и выявлении потенциального источника инфекции человека7,8, 9,10 и в проверке эффективности санитарных мер11.
До сих пор выявление вирусов в этих сценариях опиралось на квалифицированный персонал и сложную логистику. VirWaTest (virwatest.org) направлена на разработку простого, доступного и портативного метода концентрации и последующего обнаружения вирусов из проб воды в момент использования.
Концентрация вируса основана на принципе органической флоккуляции 10 Л проб воды, с помощью которых вирусы восстанавливаются в меньших объемах12,13. Флоксы собираются и добавляются в буфер, который лизирует вирусы и предотвращает деградацию нуклеиновых кислот при их комнатной температуре не более 2 недель.
Метод извлечения нуклеиновой кислоты основан на использовании магнитных частиц, к которым адсорбируются нуклеиновые кислоты. Они могут быть переданы из одного буфера стирки в другой и, наконец, в буфер elution с помощью магнитной пипетки, к которой прикрепляются частицы. Полученные вирусные нуклеиновые кислотные суспензии могут быть отправлены в референтную лабораторию, где обнаружение может быть выполнено с использованием молекулярных методов, основанных на ПЦР. Для каждой добычи нуклеиновой кислоты, два различных количества тестируются, чтобы исключить ферментативное ингибирование, возникшее в образе. Кроме того, при минимальной доступности оборудования, ПЦР-тесты могут быть запущены в точке использования. Весь процесс предназначен для выполнения независимо от источника питания(рисунок 1).
Количественный ПЦР-аналитика для обнаружения HAdV, выведенного человеком и обнаруженного в пробах сточных вод в высоких концентрациях, был адаптирован для запуска в точке применения. HAdV используются в качестве человека фекальные вирусные показатели. ПЦР для количественной оценки бактериофага MS2 также был адаптирован, так как MS2 используется в VirWaTest в качестве управления процессом. Метод может быть настроен для обнаружения любого вируса, интересуемого.
После разработки метод VirWaTest был применен пользователями в двух различных условиях в Центральноафриканской Республике (RCA) и Эквадоре, обеспечивая обратную связь о применении протокола в реальных ситуациях.
Насколько нам известно, это первая процедура, которая позволяет концентрации и обнаружения вирусов в точке использования, независимо от какого-либо источника питания, большого оборудования и условий замораживания/охлаждения. Рекомендуется собрать по две реплики каждого образца воды, чтобы получить надежные результаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод VirWaTest позволяет концентрацию вирусов и извлечения нуклеиновой кислоты из проб воды в точке использования неопытными пользователями. Это доступный, быстрый и простой протокол. Концентрация основана на принципе органической флоккуляции с использованием обезжиренного молока, с п?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest — исследовательский проект, финансируемый программой HIF (Гуманитарные инновационные фонды) КОМПАНИИ ELHRA (Повышение уровня обучения и исследований в области гуманитарной помощи). Авторы признают, WASH команды, которые любезно сотрудничали в этом исследовании. Анализ образцов в Эквадоре финансировался Оксфам Эквадор и Direccion де Investigaciones де ла Universidad де-лас-Америка (AMB. BRT.17.01). С. Бофилл-Мас является стипендиатом Серра-Хантер в Университете Барселоны.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
Riferimenti
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
