Summary

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

Published: November 17, 2018
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Summary

As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.

Abstract

Nós desenvolvemos uma ferramenta para enriquecer e expandir as células T antígeno-específicas. Isto pode ser útil em casos como de A) detectar a existência de pilhas de T antígeno-específicas, B) sondar a dinâmica das respostas antígeno-específicas, C) compreender como antígeno-específicos respostas afetam o estado de doença, tais como a auto-imunidade, D) desmistificar heterogêneos respostas de células T antígeno-específicas, ou E) utilizam células antígeno-específicas para a terapia. A ferramenta baseia-se em uma partícula magnética que nós conjugado antígeno-específicas e sinais co-estimulatória de célula T, e que nós chamamos como apresentadoras artificial de células (aAPCs). Consequentemente, uma vez que a tecnologia é simples de produzir, ele pode facilmente ser adotado por outros laboratórios; assim, nosso objetivo aqui é descrever detalhadamente a fabricação e o uso subsequente da aAPCs. Nós explicamos como anexar antígeno-específicas e co-estimulatória sinais para a aAPCs, como utilizá-los para enriquecer para as células T antígeno-específicas e como expandir as células T antígeno-específicas. Além disso, destacaremos considerações com base em informações experimentais e biológicas de nossa experiência com caracterizando as células T antígeno-específicas de projeto de engenharia.

Introduction

Com a ascensão de muitos imunoterapias, há uma necessidade de ser capaz de caracterizar e controlar respostas imunes. Em particular, a resposta imune adaptativa é de interesse devido a especificidade e a durabilidade das pilhas. Recentemente, terapias de células T de receptor de antígeno quimérico foram aprovadas para a terapia do câncer; no entanto, os receptores de antígeno são baseados fora comum célula superfície antígeno CD19, em vez dos antígenos específicos para o câncer1. Além da especificidade, imunoterapias também podem sofrer com a falta de controle e limitada a compreensão da resposta imune dinâmica dentro de câncer ou auto-imunidade.

Um dos desafios de estudar respostas antígeno-específicas é sua extremamente baixa frequência, por exemplo., as células T antígeno-específicos são 1 de cada 104 106 T células2,3. Assim, para investigar qual T células estão presentes ou respondendo, as células precisam tanto ser enriquecido e ampliado, ou o sinal deles precisa ser amplificado. É caro e difícil de manter as células de alimentador usando técnicas atuais que incidem sobre a expansão de células antígeno-específicas. Células de técnicas atuais que enfocam amplificando o sinal de T antígeno-específicos, como a enzima-lig immunospot (ELISPOT) do ensaio, limitar a re-utilização dessas células T4. Finalmente, devido à baixa sensibilidade, muitas vezes estas duas técnicas precisam ser combinada para enumeração de antígeno-específicas.

Para solucionar esses problemas, nós desenvolvemos o antígeno de artificiais baseados em nanopartículas magnéticas apresentando célula (aAPC)5,6,7,8. A aAPC pode ser acrescida com um complexo antígeno-específicas-peptídeo sinal carregado histocompatibilidade (pMHC) – e moléculas coestimulatórias –ex., um anticorpo anti-CD28-para ambos enriquecer as células T antígeno-específicas e então posteriormente estimule sua expansão (Figura 1). As partículas, portanto, podem ser um produto de prateleira econômico que pode ser tanto personalizado para atender a estímulos de antígeno-específicas ainda padronizado através de experimentos e pacientes. Realizar o enriquecimento e a expansão processar resultados em centenas de milhares-dobra expansão de células T CD8 + de antígeno-específicas e pode resultar em frequências de até 60% após apenas uma semana, permitindo a caracterização ou uso terapêutico do grande número de células. Aqui, descrevemos como fazer nanopartículas aAPCs, algumas considerações de projeto crítico em escolher as propriedades de nanopartículas e demonstrar alguns resultados típicos de utilizar essas partículas no isolamento e na expansão raras células de CD8 + T antígeno-específicas.

Protocol

Todos os ratos foram mantidos as orientações aprovadas pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Johns Hopkins. 1. carregar a proteína de fusão de imunoglobulina dimérica Major complexo de histocompatibilidade (MHC-Ig) com antígeno desejado peptídeo de sequência. Nota: Se usar o H – 2Kb: Ig e, em seguida, siga o protocolo detalhado no passo 1.1; se usar o H-2Db:Ig e, em seguida, siga o protocolo detalhado no passo 1.2. Ativo de carreg…

Representative Results

Para completar um enriquecimento sucesso e expansão das células T antígeno-específicos, o peptídeo-carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias devem ser anexadas com sucesso para a partícula aAPC. Baseado nos 3 métodos de fixação de partícula, nós fornecemos alguns dados representativos para um resultado do processo de conjugação bem sucedida (Figura 5a). Com efeito, se a densidade de ligante é muito baixa, então não haverá estimulação …

Discussion

Nós criamos uma tecnologia de isolamento romance celular de T antígeno-específicos com base em nanopartículas artificial células apresentadoras (aAPCs). Nanopartículas aAPCs peptídeo-carregou MHC na superfície que permite a ligação de pilha de T antígeno-específicas e ativação ao lado de ativação co-estimulatória. aAPCs também são paramagnéticos e assim pode ser usados para enriquecer as células T antígeno-específicas raras usando um campo magnético. Nós temos otimizado e estudou Propriedades de …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.W.H. obrigado NIH câncer nanotecnologia centro de treinamento no Instituto Johns Hopkins para nanobiotecnologia, a nacional Science Foundation Graduate bolsa de pesquisa (DGE-1232825) e a Fundação de arcos de apoio à comunhão. Este trabalho foi financiado pelo apoio do National Institutes of Health (R21 de P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de inovação TEDCO/Maryland e a Fundação de Coulter (JPS).

Materials

DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

Riferimenti

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

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Citazione di questo articolo
Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

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