Summary

豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開

Published: November 17, 2018
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Summary

抗原特異的 T 細胞は特性またはその極低周波による治療を利用しにくい。本明細書で我々 はこれらの細胞を豊かにする抗原特異的 T 細胞に結合することができます磁性粒子を開発するためのプロトコルを提供し、それらをいくつか展開する特性評価および治療の両方の 100 倍。

Abstract

両方豊かにし、抗原特異的 T 細胞を拡大するツールを開発しました。これは A) 抗原特異的 T 細胞の存在を検出、B) 抗原特異的応答のダイナミクスのプローブ、C) を理解するよう場合に有用することができます抗原特異的応答など自己免疫疾患の状態に影響を与える、どのように D) 分かり異種抗原特異的 T 細胞、または E の応答) は、抗原特異的細胞療法を利用します。ツールは、抗原特異的および T 細胞共刺激シグナルを共役我々 ことと人工抗原提示細胞 (aAPCs) として長期的に磁性粒子に基づいています。その結果、技術は生成に簡単です、のでそれが簡単に採用される; 他の所でしたがって、本研究の目的は作製と、aAPCs の後の使用について詳しく説明します。我々 は、aAPCs に特定の抗原、共刺激シグナルを添付する方法、抗原特異的 T 細胞を豊かにするそれらを活用する方法と抗原特異的 T 細胞を拡張する方法について説明します。さらに、我々 は設計の考慮事項は、抗原特異的 T 細胞を特徴と私たちの経験の実験的および生物学的情報に基づくを強調表示されます。

Introduction

多くの免疫療法の上昇、特性し、免疫応答を制御することができる必要があります。特に、適応免疫応答は、関心の特異性とセルの耐久性のためです。最近では、キメラ抗原受容体の T 細胞療法がん治療として承認されましたしかし、抗原受容体は、がん1に固有の抗原ではなくに一般的な細胞表面抗原 CD19、オフに基づいています。を超えて、特異性免疫療法もコントロール、および限られたがんや自己免疫疾患に免疫応答を理解の欠如から苦しむことができます。

抗原特異的応答の研究の課題の一つは、超低周波、 e.g。、抗原特異的 T 細胞がすべての 10 の 14 106 T 細胞2,3。したがって、T を調査する細胞が存在または応答して、セルを充実・拡大し、する必要がありますまたはその信号を増幅する必要があります。高価、抗原特異的細胞の拡大に焦点を当てた現在の技術を使用してフィーダー細胞を維持することは困難です。抗原特異的 T の信号増幅に焦点を当てた現在の技術細胞、酵素 immunospot (しなさい) 試金のようなこれらの T 細胞4の再利用を制限します。最後に、感度が低いためしばしばこれらの 2 つの手法組み合わせることが必要抗原特定の列挙。

これらの問題に対処するため、磁性ナノ粒子を用いた人工抗原提示細胞 (aAPC)5,6,78を開発しました。AAPC は抗原特異的信号ペプチド ロード主要組織適合遺伝子複合体 (pMHC) と共刺激分子修飾することができます例えば、抗 CD28 抗体-抗原特異的 T 細胞を豊かにし、その後。(図 1) の拡大を刺激します。粒子は、抗原特異的刺激に合わせてカスタマイズまだ実験と患者全体で標準化することができますコスト効果の高い市販製品をすることができます。濃縮および拡張を実行する抗原特異的 cd 8 + T 細胞の数千倍の拡大に何百もの結果の処理、周波数で起因できる特性や大型の治療上の使用を有効にするちょうど 1 週間後に 60%セルの数。ここ、ナノ粒子 aAPCs、ナノ粒子のプロパティを選択する際にいくつかの重要な設計の考慮事項を確認する方法について説明し、これらの粒子を分離すると、希少な抗原特異的 cd 8 + T 細胞の拡大を利用してからいくつかの典型的な結果を示します。

Protocol

すべてのマウスは、ジョンズ ・ ホプキンス大学の制度検討委員会によって承認されたガイドラインに従って維持されました。 1. 目的の抗原ペプチド配列と二量体の主要組織適合抗原免疫グロブリン融合蛋白質 (MHC Ig) をロードします。 注: H-2 Kb を使用している場合: Ig、次手順 1.1; で詳細なプロトコルH を使用している場合-2Db:Ig、次のステップ 1.2 詳?…

Representative Results

成功した濃縮と抗原特異的 T 細胞の拡大を完了するため、ペプチド負荷 MHC Ig と共刺激分子などへ aAPC 粒子に正常にアタッチする必要があります。粒子の添付ファイルの 3 つの方法に基づいて、成功活用手順結果 (図 5 a) のいくつかの代表的なデータをいたします。確かに、配位子濃度が低すぎる場合ができなくなりますこれが線形間隔 100 を超?…

Discussion

我々 は、ナノ人工抗原提示細胞 (aAPCs) に基づく新規抗原特異的 T 細胞の分離技術を作成しています。ナノ粒子 aAPCs ペプチド-読み込まれている MHC 抗原特異的 T 細胞のバインディングとアクティベーション共刺激活性化と一緒にことができる表面に。aAPCs は、常磁性、また、したがって磁場を用いた希少な抗原特異的 T 細胞を豊かにするために使用できます。我々 は最適化し、キー ナノ粒子…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.W.H. は、ナノバイオ テクノロジー、国立科学財団大学院研究員 (DGE-1232825) と交わりを支える円弧財団のジョンズ ・ ホプキンズ大学で NIH がんナノテクノロジー トレーニング センターを感謝します。この作品は、コールター財団 (JPS)、テッドコー/メリーランド州イノベーション イニシアチブ健康の国民の協会 (P01-AI072677、R01-CA108835、R21-CA185819) からの支援によって賄われていた。

Materials

DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

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