풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포
Summary
항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.
Abstract
우리는 모두 풍부 하 고 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 도구를 개발 했습니다. 이 B) 항 원 특정 응답의 역학 조사, A) 항 원 특정 T 세포의 존재를 검출 하는 C) 이해에 같은 경우에 도움이 될 수 항 원 특정 응답 자가 면역 질병 상태에 영향을, 어떻게 D) demystify 이기종 항 원 특정 T 세포, 또는 전자에 대 한 응답) 치료에 대 한 항 원 특정 셀을 사용합니다. 도구 자성 입자에에 따라 우리 항 원 특정 및 T 셀 co-stimulatory 신호, 켤레는 우리가 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)으로 기간. 따라서, 기술 생산 간단 이기 때문에, 그것은 쉽게 채택 될 수; 다른 실험실에 의해 따라서, 우리의 목적을 여기 제조와는 aAPCs 사용 자세하게에서 설명 이다. 우리는 aAPCs를 항 원 특정 및 co-stimulatory 신호를 연결 하는 방법, 항 원 특정 T 세포에 대 한 풍부 하 게 그들을 활용 하는 방법 및 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 엔지니어링 디자인 고려 사항 항 원 특정 T 세포 특성화와 우리의 경험의 실험 및 생물 정보에 따라 강조 표시 됩니다.
Introduction
많은 immunotherapies의 증가 함께 특성화 및 면역 반응을 제어할 수 있을 필요가 있다. 특히, 적합 한 면역 반응 특이성 및 셀의 내구성 때문에 관심사의 이다. 최근, 공상 항 원 수용 체 T 세포 치료 암 치료; 대 한 승인 되었습니다. 그러나, 항 원 수용 체는 일반적인 세포 표면 항 원 CD19, 특정 암1항 대신 떨어져 근거한 다. 특이성, 넘어 immunotherapies 제어, 그리고 제한 된 암이 나 자가 면역 내 동적 면역 반응을 이해의 부족에서 또한 겪을 수 있다.
항 원 특정 응답을 공부 하는 과제 중 하나는 그들의 매우 낮은 주파수, 예를 들어., 항 원 특정 T 세포는 모든 10의 14 106 T 세포2,3. 따라서, 조사는 T 세포가 존재 하거나, 셀 중 농축 하 고 확장 될 필요가 그들의 신호 증폭 될 필요가. 그것은 비싼 고 항 원 특정 셀의 확장에 초점을 현재 기법을 사용 하 여 피더 세포를 유지 하기 어렵다입니다. 항 원 특정 T의 신호 증폭에 초점 현재 기술을 세포, 효소 연결 된 immunospot (ELISPOT) 분석 결과 처럼, 다시 그 T 세포4의 사용 제한. 마지막으로, 낮은 감도 때문에 종종 이러한 두 기술이 필요 항 원 특정 열거형에 대 한 결합.
이러한 문제를 해결 하는 자기 나노 입자 기반 인공 항 원 제시 세포 (aAPC)5,6,7,8개발 했습니다. aAPC와 항 원 특정 신호 펩 티 드 로드 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)-co-stimulatory 분자-functionalized 수예., 안티 CD28 항 체-둘 다 풍부 항 원 특정 T 세포 그리고 그 후 (그림 1) 그들의 확장을 자극. 따라서 입자는 비용 효율적인 상용 제품을 수 모두 항 원 특정 stimulations를 충족 하도록 사용자 정의 아직 실험 및 환자 표준화 수 있다. 농축 및 확장 수행 항 원 특정 CD8 + T 세포의 수천 배 확장 수백에서 결과 처리 하 고 주파수에서 발생할 수 있습니다 최대 60% 단지 1 주일 후 특성 또는 대형의 치료 사용 셀의 수입니다. 여기, 우리는 나노 aAPCs, 나노 속성 선택에 몇 가지 중요 한 디자인 고려 사항을 확인 하는 방법을 설명 하 고에서 분리 하 고 확장 하는 희귀 한 항 원 특정 CD8 + T 세포에이 입자를 활용 하 여 몇 가지 전형적인 결과 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 새로운 항 원 특정 T 세포 격리 기술 나노 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)에 기반을 만들었습니다. 나노 aAPCs 펩 티 드-로드 MHC T 세포 항 원 특정 바인딩 및 co-stimulatory 활성화 함께 활성화를 허용 하는 표면에 합니다. aAPCs 상자성, 있으며 따라서 자기장을 사용 하 여 희귀 한 항 원 특정 T 세포를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 우리는 최적화 하 고 주요 나노 크기, ligand 밀도, 그리고 ligand 선택과…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H.는 NanoBioTechnology, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 (DGE-1232825), 및 장학금 지원에 대 한 호 재단에 대 한 존스 홉킨스 연구소에서 NIH 암 나노기술 교육 센터를 감사합니다. 이 작품에서 건강의 국가 학회 (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/메릴랜드 혁신 이니셔티브, Coulter 재단 (JPS) 지원에 의해 투자 되었다.
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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