כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.
במשך כמעט 40 שנה, הזרקת הדנ א pronuclear מייצג את השיטה הרגילה כדי להפיק העכברים הטרנסגניים עם שילוב אקראי של transgenes. בדיקה שגרתית הוא מנוצל באופן נרחב ברחבי העולם ומתגורר הגבלה העיקריים שלה היעילות העניים של אינטגרציה transgene, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה של מייסד חיות. רק אחוזים בודדים של בעלי חיים שנולד אחרי ההשתלה של oocytes מופרית מוזרק שילבו את transgene. לעומת זאת, וקטורים lentiviral הם כלים רבי-עוצמה עבור העברה גנטית אינטגרטיבית, השימוש שלהם כדי מגלי oocytes מופרית מאפשר הפקה יעילה במיוחד של מייסד העכברים הטרנסגניים עם תשואה ממוצעת מעל 70%. יתר על כן, כל זן העכבר יכול לשמש כדי לייצר חיים מהונדס, והוא penetrance הביטוי transgene גבוהה מאוד, מעל 80% עם lentiviral transgenesis בתיווך בהשוואה ל- DNA microinjection. גודל המקטע דנ א זה יכול להיות מטען על ידי וקטור lentiviral מוגבל ל 10 kb ומייצג המגבלה העיקרית של שיטה זו. שימוש פשוטה וקלה לביצוע הליך הזרקת מתחת zona pellucida של oocytes מופרית, יותר מ 50 מייסד בעלי חיים יכול להיות מיוצר בחצר מושב בודד של microinjection. השיטה היא מאוד מותאם לביצוע, ישירות במייסד חיות, רווח מהיר, אובדן של תפקוד לימודי או לאזורים דנ א גנומי מסך, ביכולתם לשלוט ולווסת ג’ין ביטוי ויוו.
עבודתה החלוצית של גורדון. et al. 1980 הראה כי לאחר ההשתלה בעכברים pseudopregnant, דנ א פלסמיד הזרקה לתוך זכר pronuclei של oocytes מופרית ניתן תשואות ייצור הטרנסגניים חיות משולב פלסמיד DNA1. ההפגנה יונקים הטרנסגניים יכול להיווצר הייתה השפעה עצומה על מדעי החיים הכללית, פתיחת הדרך לשדות הרומן של המחקר הן עבור מדעי ביו translational מדעים בסיסיים. ארבע העשורים האחרונים, הפך ה-DNA microinjection אימון שגרתי. למרות מספר עצום של העכברים הטרנסגניים הופקו, השיטה הרגילה אינה שמישים לחלוטין עבור כל עכבר זנים ודורשת זמן רב בנשימה ובריכוז2,3. היישום שלה למינים אחרים נותר מאתגר4 , התשואה הכוללת של אינטגרציה transgene מוגבלת כמה אחוז בעלי חיים נולד ב5. בנוסף, היעילות של אינטגרציה transgene מייצג את הגורם המגביל המסביר את התשואה הכוללת המסכן של הזרקת הדנ א pronuclear. במובן זה, וקטורים ויראלי אינטגרטיבית הם הכלים היעילה ביותר כדי מטען לשלב את transgenes ואת ובכך יכול לספק אמצעי חדש להגביר משמעותית את התשואה אינטגרציה, המגבלה היחידה כל כך גודל transgene לא עולה על 10 kb6 .
מדומים מוקלד עם החלבון envelop וירוס Vesicular Stomatitis (VSV) lentiviral וקטורים הם כלי העברת הגנים pantropic ו אינטגרטיבית מאוד והוא יכול לשמש כדי מגלי מופרית oocytes7. Zona pellucida המקיפים את oocytes היא מכשול טבעי וירוס וצריך לעבור כדי לאפשר התמרה חושית עם הווקטורים lentiviral. חיות הטרנסגניים נוצרו על-ידי transducing oocytes מופרית לאחר קידוח מיקרו או הסרה של8, zona pellucida9. עם זאת, הזרקה מתחת zona pellucida בחלל perivitelline נראה כי השיטה הפשוטה ביותר כדי מגלי הביצים כפי שמתואר בתחילה על ידי לואיס ועמיתיו7.
הזרקת perivitelline של וקטורים lentiviral מאפשרת תפוקה גבוהה ייצור הטרנסגניים חיות מעל 70% של בעלי חיים נולד. תשואה כזו היא מעל 10-fold גבוה יותר מאשר התשואה הטובה ביותר זה יכולה להיות מושגת באמצעות תקן pronuclei DNA הזרקת7,10,11. בהקשר זה, מושב בודד של זריקות יפיק לפחות 50 הטרנסגניים המייסדים (F0). המספר הגדול של מייסדי הוא, לכן, תואם עם phenotyping של האפקט transgene מתבצע ישירות על עכברים F0 ללא צורך ליצור קווים העכבר מהונדס. יתרון זה מאפשר להקרנה מהירה של האפקט transgene, מותאם במיוחד לביצוע ויוו להפסד ורווח של מחקרים פונקציה בתוך שבועות. בנוסף, רכיבי ה-DNA תקינה יכולים גם להיות במהירות מוקרן למפות משפרי ומוטיבים DNA מחויב על ידי שעתוק גורמים11,12. עם זריקות pronuclear, transgenes בדרך כלל לשלב עותקים מרובים כמו ב לוקוס ייחודי. עם וקטורים lentiviral, אינטגרציה מתרחשת לוקוסים מרובים כעותק יחיד לכל לוקוס10,13. לכן, הריבוי של לוקוסים משולב הוא ככל הנראה קשור penetrance ביטוי גבוהה מאוד שנצפתה הטרנסגניים המייסדים, מה שהופך את המודל החדש שנוצר עמידים יותר.
חשוב, כאשר באמצעות הזרקת pronuclear של ה-DNA, ויזואליזציה של pronuclei במהלך ההליך הוא בהחלט נדרש. מגבלה טכנית זו מונעת את השימוש oocytes מופרית שמקורם במגוון גדול של זנים העכבר. לכן, הפקה של מודל הטרנסגניים מסוימים מסננים עבור אילו pronuclei הן בלתי נראות דורש את הייצור של בעלי חיים בגן זן מתירניות ואחריו בנשימה ובריכוז רצופים לפחות 10 כדי להעביר את transgene העכבר הרצוי זן. עם הזריקות וקטור lentiviral, שטח perivitelline גלוי תמיד ואת הזריקה אינה דורשת מיומנויות ספציפיות מאוד. לדוגמה, העכברים הטרנסגניים הנד/SCID אינן מתאימות pronuclei הזרקת הושגו עם זריקות וקטור ויראלי14.
. הנה, פרוטוקול מקיף מוצג כדי לאפשר ייצור פשוטה של העכברים הטרנסגניים באמצעות זריקות lentiviral וקטור במרחב perivitelline של העובר בשלב תא אחד. הביטוי Transgene נשלט עם כל אחד בכל מקום או תאים ספציפיים היזמים מתואר בפירוט.
PTrip ΔU3 עמוד השדרה lentiviral היה בשימוש במחקר זה15. וקטור זה מאפשר הפקת שכפול וקטורים lentiviral הפגום שבו הרצף U3 חלקית נמחק כדי להסיר U3 יזם פעילות ולהפיק וקטור (חטא) עצמית inactivating16. וקטור lentiviral מניות יוצרו על ידי תרביות תאים ארעית של תאים HEK-293T עם p8.91 כימוס פלסמיד (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, קידוד ה גליקופרוטאין-G וירוס (VSV) vesicular stomatitis17, ו ΔU3 pTRIP את pHCMV-G וקטור recombinant. הנוהל מפורט ייצור מסופק שיטות משלימות.
הפקה של כייל נוגדנים גבוה וקטור lentiviral מניות מבוצעת בתנאים אבטחה ברמה II (BSL-2). זה נכון לגבי רוב transgenes חוץ oncogenes חייב להיות מיוצר BSL-3. לכן, ייצור בתנאים BSL-2 ברוב המקרים מספיקה. בנוסף, השימוש ואת הייצור מנותקים בדרך כלל עבור סוכנויות רגולציה הלאומית ביותר העוסקים אורגניזמים מהונדס גנטית (GMO). כמות מוגבלת של שכפול לא מוכשר חטא lentiviral וקטורים (מתחת µg 2 של חלבון p24 capsid) יכול לשמש בתנאים BSL-1 כפי שתואר על ידי הסוכנות הצרפתית GMO מסכים עם המלצות האיחוד האירופי.
הזרקה perivitelline של וקטורים lentiviral ב oocytes מופרית המתוארים כאן הביא ייצור הטרנסגניים עוברי הניב יותר מ 70% של העוברים הטרנסגניים ביחס המספר הכולל של עוברי שנאספו. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים, מדגימה יחודיות של הליך2,7,10,<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים Magali דומונט, מלוני רולנדו על קריאה ביקורתית של כתב היד ואת iVector Phenoparc ICM ליבות לקבלת סיוע טכני בארצות וקטור lentiviral הייצור של בעלי חיים דיור בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי דה Translationnelles אינסטיטוט Hospitalo-Universitaire דה מדעי המח בפריז, IHU-A-ICM, Investissements d’Avenir ANR-10-IAIHU-06. יחסי ציבור קיבל מימון עבור פרנסז Langue de האגודה למזוג l’Etude du Diabète et des מחלות Métaboliques (ALFEDIAM), של האגודה לסוכרת נעורים משותפת / INSERM הענק.
PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
NaCl | Sigma | 7982 | |
100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
M2 medium | Sigma | M7167 | |
M16 medium | Sigma | M7292 | |
0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
Curved forceps | Moria | 2183 | |
Curved scissors | Moria | MC26 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
Microforge | Narishige | MF-900 | |
Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
ocrygel | centravet | OCR002 | |
Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
EDTA | Sigma | E9884 | |
SDS | Sigma | 436143 | |
NaCl | Sigma | S7653 | powder |
proteinase K | Sigma | P2308 | |
oneTaq kit | NEB | M0480L | |
Primers | Eurogentec | ||
Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |