Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l’integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.
Abstract
Per quasi 40 anni, pronuclei iniezione di DNA rappresenta il metodo standard per generare topi transgenici con integrazione casuale dei transgeni. Una procedura di routine è largamente utilizzata in tutto il mondo e il suo limite principale risiede nella scarsa efficacia di integrazione del transgene, risultante in una bassa resa di animali fondatore. Solo qualche punto percentuale di animali nati dopo l’impianto di iniezione ovociti fecondati hanno integrato il transgene. Al contrario, vettori lentivirali sono potenti strumenti per il trasferimento genico integrativa e il loro utilizzo di trasdurre ovociti fecondati permette una produzione altamente efficiente del fondatore topi transgenici con un rendimento medio superiore al 70%. Inoltre, tutto lo sforzo del mouse può essere utilizzato per la produzione di animali transgenici e la penetranza di espressione del transgene è estremamente elevata, superiore all’80% con vettori lentivirali transgenesi mediata rispetto alla microiniezione di DNA. La dimensione del frammento del DNA che può essere carico di vettore lentivirale è limitata a 10 kb e rappresenta la maggiore limitazione di questo metodo. Utilizzando un semplice e facile da eseguire la procedura di iniezione sotto la zona pellucida degli ovociti fecondati, più di 50 animali fondatore possono essere prodotto in una singola sessione di microiniezione. Tale metodo è altamente adattato per eseguire, direttamente in animali fondatore, rapido guadagno e la perdita di studi di funzione o di regioni di DNA genomiche di schermo per la loro capacità di controllare e regolare espressione genica in vivo.
Introduction
Il lavoro pionieristico di Gordon et nel 1980 hanno mostrato che dopo l’impianto in pseudopregnant topi, l’iniezione di DNA del plasmide nel maschio pronuclei di ovociti fecondati può produrre la produzione di animali transgenici che integrano la plasmide DNA1. La dimostrazione che possono essere generati mammiferi transgenici ha avuto un enorme impatto sulle scienze della vita globale, aprendo la strada a nuovi campi di ricerca sia per le scienze di base e traslazionale scienze biomediche. Negli ultimi quattro decenni, microiniezione di DNA è diventata una pratica di routine. Anche se è stati prodotti un numero enorme di topi transgenici, il metodo standard non è pienamente utilizzabile per tutti i ceppi di topi e richiede molto tempo reincroci2,3. Sua applicazione ad altre specie rimane impegnativo4 e il rendimento generale di integrazione del transgene è limitato a qualche percentuale di animali nati5. Inoltre, l’efficacia dell’integrazione del transgene rappresenta il fattore limitante che spiega la scarsa resa dei pronuclei iniezione di DNA. A questo proposito, vettori virali integranti sono gli strumenti più efficienti per carico e integrano transgeni e così potrebbero fornire nuovi mezzi per aumentare significativamente la resa di integrazione, l’unica limitazione è che la dimensione del transgene che non può superare i 10 kb6 .
Vettori lentivirali pseudo-tipizzati con la proteina di busta del Virus della stomatite vescicolare (VSV) sono strumenti di trasferimento del gene PANTROPICO e altamente integrativa e possono essere utilizzati per trasdurre ovociti fecondati7. La zona pellucida che circonda gli ovociti è una barriera naturale virus e deve essere passato per consentire di trasduzione con i vettori lentivirali. Gli animali transgenici sono stati generati da transducing ovociti fecondati dopo micro-foratura o la rimozione della zona pellucida8,9. Tuttavia, iniezione sotto la zona pellucida nello spazio perivitellino sembra essere il metodo più semplice di trasdurre le uova fecondate come inizialmente descritto da Lois e colleghi7.
L’iniezione di perivitellino di vettori lentivirali permette rendimenti elevati nella produzione di animali transgenici che sono sopra il 70% degli animali nati. Tale rendimento è oltre 10 volte superiore rispetto al rendimento migliore che può essere raggiunto utilizzando standard pronuclei DNA iniezione7,10,11. In questo contesto, una singola sessione di iniezioni genererà almeno 50 transgenici fondatori (F0). Il gran numero di fondatori è, pertanto, compatibile con fenotipizzazione del transgene effetto possono essere effettuata direttamente su F0 topi senza la necessità di generare linee di topi transgenici. Questo vantaggio permette per screening rapido dell’effetto del transgene ed è stato adattato da eseguire in vivo guadagno e la perdita della funzione studia in settimane. Inoltre, elementi regolatori del DNA possono anche essere rapidamente schermati per mappa esaltatori e DNA motivi vincolati dalla trascrizione fattori11,12. Con iniezioni di pronuclei, transgeni integrano solitamente come più copie di un unico locus. Con vettori lentivirali, integrazione si verifica in luoghi multipli come una singola copia per locus10,13. Pertanto, la molteplicità di loci integrati è probabilmente associati alla penetranza di altissima espressione osservata nei fondatori transgenici, che rende più robusto il nuovo modello generato.
Cosa importante, quando si utilizza pronuclei iniezione del DNA, visualizzazione dei pronuclei durante la procedura è assolutamente necessaria. Questa limitazione tecnica impedisce l’utilizzo di ovociti fecondati provenienti da una grande varietà di ceppi di topi. Di conseguenza, la produzione di un modello transgenico in uno specifico ceppo per cui pronuclei sono invisibili richiede la produzione di animali in un ceppo permissivo seguita da almeno 10 successive reincroci per trasferire il transgene nel topo desiderata ceppo. Con le iniezioni di vettore lentivirale, spazio perivitellino è sempre visibile e l’iniezione non richiede competenze altamente specifiche. Ad esempio, topi transgenici NOD/SCID che non sono appropriati per l’iniezione di pronuclei sono stati ottenuti con il vettore virale iniezioni14.
Qui, un protocollo completo viene visualizzato per consentire la semplice produzione di topi transgenici con iniezioni di vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un embrione di fase di una cella. Controllata sia con l’espressione del transgene onnipresente o promotori specifici delle cellule è descritto in dettaglio.
La spina dorsale di vettori lentivirali di ΔU3 pTrip è stata utilizzata in questo studio15. Questo vettore permette per la produzione di vettori lentivirali difettoso di replica in cui la sequenza di U3 è stato parzialmente eliminata per rimuovere l’attività del promotore U3 e generare un self-inattivazione di vettore (SIN)16. Scorte di vettore lentivirale sono state prodotte da transitori di transfezione delle cellule HEK 293T con il p8.91 incapsulamento plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G codifica la stomatite vescicolare (VSV) virus glicoproteina-G17e il ΔU3 di pTRIP vettore ricombinante. La procedura dettagliata di produzione viene fornita come metodi supplementari.
Produzione delle scorte di vettore lentivirale alto titolo viene eseguita in condizioni di biosicurezza livello II (BSL-2). Questo è vero per la maggior parte dei transgeni ad eccezione di oncogeni che devono essere prodotti in BSL-3. Di conseguenza, la produzione in condizioni di BSL-2 per la maggior parte dei casi è sufficiente. Inoltre, l’uso e la produzione sono solitamente disconnesso per la maggior parte delle agenzie di regolamentazione nazionale, a che fare con organismi geneticamente modificati (OGM). Quantità limitate di vettori lentivirali di peccato incompetenti di replica (sotto 2 µ g di proteina del capside p24) può essere utilizzato in condizioni di BSL-1 come descritto dall’Agenzia francese OGM in accordo con le raccomandazioni dell’Unione europea.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’iniezione di perivitellino di vettori lentivirali in ovociti fecondati qui descritti ha provocato la produzione di embrioni transgenici che ha reso più del 70% degli embrioni transgenici rispetto al numero totale di embrioni raccolti. Questo risultato è coerenza con i rapporti precedenti ed esemplifica la specificità della procedura2,7,10,11,12. Quando si…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Magali Dumont e Rolando Meloni per lettura critica del manoscritto e la iVector e Phenoparc ICM core per l’assistenza tecnica nella produzione del vettore lentivirale e animale alloggiamento rispettivamente. Questo lavoro è stato supportato dal Translationnelles Institut Hospitalo-Universitaire de neuroscienze de Parigi, IHU-A-ICM, Investissements d’Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. ha ricevuto finanziamenti per l’associazione de Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) e un comune JDRF / INSERM grant.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
Riferimenti
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
