Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.
Abstract
Depuis près de 40 ans, injection d’ADN pronucléaire représente la méthode standard pour générer des souris transgéniques avec intégration aléatoire des transgènes. Une telle procédure systématique est largement utilisée dans le monde entier et sa principale limitation réside dans l’efficacité médiocre de l’intégration de transgene, ce qui entraîne un faible rendement des animaux fondateurs. Seulement quelques pour cent des animaux nés après l’implantation des ovocytes fécondés injectés ont intégré le transgène. En revanche, les vecteurs LENTIVIRAUX sont des outils puissants pour le transfert de gène intégrative et leur utilisation pour transmettre les ovocytes fécondés permet une production très efficace du fondateur de souris transgéniques avec un rendement moyen supérieur à 70 %. En outre, toute souche de souris peut être utilisé pour produire des animaux transgénique et la pénétrance d’expression du transgène est extrêmement élevée, supérieur à 80 % avec des gènes transgénèse médiée par rapport à la microinjection de DNA. La taille du fragment ADN qui peut être des marchandises par le vecteur lentiviral est limitée à 10 Ko et représente la limitation majeure de cette méthode. À l’aide d’un simple et facile à exécuter la procédure d’injection sous la zone pellucide des ovocytes fécondés, plus de 50 animaux fondateurs peut être produites en une seule séance de microinjection. Une telle méthode est très adaptée pour effectuer, directement aux animaux fondateurs, gain rapide et perte de fonction ou de régions d’ADN génomiques écran pour leur capacité à contrôler et réglementer gene expression in vivo.
Introduction
Le travail de pionnier de Gordon et coll. en 1980 ont montré qu’après l’implantation chez des souris pseudopregnant, l’injection d’ADN de plasmide dans pronucléus mâle d’ovocytes fécondés peut produire la production d’animaux transgéniques qui intègre la l’ADN de plasmide1. La démonstration que les mammifères transgéniques peuvent être générés a eu un impact énorme sur les sciences de la vie mondiales, ouvrant la voie aux nouveaux champs de recherche pour les sciences fondamentales et sciences biomédicales translationnelles. Au cours des quatre dernières décennies, la microinjection de DNA est devenu une pratique courante. Bien qu’un grand nombre de souris transgéniques ont été produit, la méthode standard n’est pas parfaitement utilisable pour toutes les souches de souris et fonctionne avec votre temps rétrocroisements2,3. Son application à d’autres espèces reste difficile4 et le rendement global de l’intégration des transgènes est limité à quelques pourcentage d’animaux né5. En outre, l’efficacité de l’intégration du transgène représente le facteur limitant qui explique le faible rendement global de pronucléaire injection d’ADN. À cet égard, les vecteurs viraux intégratives sont les outils les plus efficaces pour la marchandise et intègrent des transgènes et ainsi pourraient fournir de nouveaux moyens d’augmenter sensiblement le rendement de l’intégration, la seule limite étant que la taille du transgène qui ne doit pas dépasser 10Ko6 .
Les vecteurs LENTIVIRAUX Pseudo-aléatoire typés avec la protéine de l’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sont des outils de transfert de gène Pantropes et hautement intégrative et peuvent être utilisés pour transmettre des ovocytes fécondés7. La zone pellucide entourant les ovocytes est une barrière naturelle virus et doit être transmis pour permettre la transduction avec les vecteurs LENTIVIRAUX. Animaux transgéniques ont été générés par transduction ovocytes fécondés après forage au micro ou de la suppression de la zone pellucide8,9. Cependant, injection sous la zone pellucide dans l’espace périvitellin semble être la méthode la plus simple pour transmettre les œufs fécondés initialement décrite par les Lois et les collègues7.
L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX permet des rendements élevés dans la production d’animaux transgéniques qui sont plus de 70 % des animaux nés. Ce rendement est de plus de 10 fois plus élevée que le meilleur rendement possible qui peut être réalisé à l’aide de standard pronucléus ADN injection7,10,11. Dans ce contexte, une seule séance d’injections va générer au moins 50 fondateurs transgéniques (F0). Le grand nombre des fondateurs est, par conséquent, compatible avec phénotypage de l’effet de transgene directement effectuée sur des souris F0 sans la nécessité de produire des lignées de souris transgéniques. Cet avantage permet un dépistage rapide de l’effet du transgène et est spécifiquement adapté pour effectuer en vivo gain et perte de fonction dans les semaines. En outre, éléments régulateurs de l’ADN peuvent également être projetés rapidement pour mapper des exhausteurs et des motifs d’ADN liés par des facteurs de transcription11,12. Pour les injections pronucléaire, transgènes intègrent généralement en plusieurs copies dans un locus unique. Avec les vecteurs LENTIVIRAUX, intégration se produit dans plusieurs loci en un seul exemplaire par locus10,13. Par conséquent, la multiplicité des loci intégrée est probablement associée à la pénétrance de très haute expression observée chez les fondateurs transgéniques, qui rend le nouveau modèle généré plus robustes.
Ce qui est important, lorsque vous utilisez pronucléaire injection d’ADN, visualisation des pronucléi au cours de la procédure est absolument nécessaire. Cette limitation technique empêche l’utilisation d’ovocytes fécondés provenant d’une grande variété de souches de souris. Par conséquent, la production d’un modèle transgénique dans un spécifique de la souche pour laquelle pronucléus sont invisibles exige la production d’animaux dans une souche permissive suivie d’au moins 10 rétrocroisements successifs de transférer du transgène chez la souris désiré souche. Avec les injections de vecteur lentiviral, espace périvitellin est toujours visible, et l’injection ne nécessite pas de compétences très spécifiques. À titre d’exemple, les souris transgéniques NOD/SCID qui ne conviennent pas pour injection pronucléus ont été obtenus avec le vecteur viral injections14.
Un protocole complet est présenté ici, afin de permettre la simple production de souris transgéniques à l’aide d’injections de vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un embryon de scène une seule cellule. Transgene expression contrôlée soit omniprésente ou promoteurs spécifiques de la cellule est décrite en détail.
L’épine dorsale des gènes de pTrip ΔU3 a été utilisé dans cette étude de15. Ce vecteur permet de produire des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux de réplication dans lequel la séquence U3 a été partiellement supprimée pour supprimer l’activité du promoteur U3 et générer une inactivation automatique vector (SIN)16. Les stocks de vecteur lentiviral ont été produits par transfection transitoire des cellules HEK-293 t avec le p8.91 encapsulation plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, le pHCMV-G codant pour la stomatite vésiculeuse virus (VSV) glycoprotéine-G17et le ΔU3 pTRIP vecteur recombinant. La procédure de production détaillé est fournie en tant que méthodes supplémentaires.
Production de stocks de vecteur lentiviral titre élevé est réalisée dans des conditions de biosécurité de niveau II (BSL-2). Cela est vrai pour la plupart des transgènes à l’exception des oncogènes qui doivent être produits au niveau de biosécurité 3. Par conséquent, la production dans des conditions de BSL-2 pour la plupart des cas est suffisante. En outre, l’utilisation et la production sont souvent déconnectés pour la plupart des organismes réglementaires nationales portant sur les organismes génétiquement modifiés (OGM). Une quantité limitée de réplication incompétent SIN vecteurs LENTIVIRAUX (en dessous de 2 µg de protéines de capside p24) peut être utilisée dans des conditions de BSL-1 tel que décrit par l’Office Français OGM en accord avec les recommandations de l’Union européenne.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX dans les ovocytes fécondés décrites ici a entraîné la production d’embryons transgéniques qui ont rapporté plus de 70 % d’embryons transgéniques par rapport au nombre total d’embryons collectés. Ce résultat est conforme aux précédents rapports et illustre la spécificité de la procédure2,7,10,11,<sup class="xr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Magali Dumont et Rolando Meloni pour une lecture critique du manuscrit iVector et carottes ICM Phenoparc d’assistance technique dans la production vecteur lentiviral et respectivement au logement des animaux. Ce travail a été soutenu par l’Institut hospitalo-universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d’avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. a reçu de financement pour l’Association de Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFÉDIAM) et un mixte FRDJ / INSERM grant.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
Riferimenti
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