レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

遺伝学的ツールが利用可能な限られた数のため、レプトスピラなどのいくつかの細菌の病原性遺伝子の同定は難しい。一般的に使用される方法の 1 つは、各変異株における挿入部位の同定と病原性の動物モデルにおける個々 のトランスポゾン変異体のテストが続くランダムなトランスポゾン変異による変異体のコレクションの作成です。この方法は時間のかかる、高価なと多数の動物が必要です。

ランダム突然変異誘発はレプトスピラ病原体の開発当初、病原性に関与する遺伝子は動物モデル¹に個々 の変異をテストによって識別されました。変異体は、その潜在的なシグナル伝達における役割または運動または予測外膜面の位置などの条件に基づいて選ばれました。レプトスピラの大半として遺伝子の未知関数²仮説蛋白質を符号化、選択する突然変異体は、これら条件制限に基づいて小説レプトスピラ病原性遺伝子を発見する能力。

最近では、 l. カバートランスポゾン変異体のプールは、ハムスターやマウスのモデル³の感染性の上映。各動物は、最大 10 の突然変異体のプールに挑戦しました。変異株の感染性は、それが血液や腎臓から得られる文化の PCR による検出された場合肯定的な得点されました。プールで各変異体の個々 の PCR 反応を必要とするため、PCR 検査は手間がかかっていました。文化各突然変異系統の周波数は定量化されていませんので、アプローチは高度弱毒化変異体の同定への試み偏っていた。

トランスポゾンの病原性遺伝子のスクリーニングより効率的にするための戦略として (Tn Seq) 手法をシーケンス処理について述べる.Tn seq は、大規模な並列シーケンス^4,5,6続いてトランスポゾン変異による変異体のライブラリの作成で構成されます。簡単に言えば、トランスポゾン変異体がプール、動物に接種、さまざまな器官 (出力プール) が治った後。出力プールから DNA は抽出し、制限の酵素と消化されるか sonication によってせん断。PCR トランスポゾン挿入サイトの接合部の 2 つのラウンドが行われます。この手順は、シーケンスに必要なアダプターを追加をできます。結果として得られる PCR の製品は、各変異体変異体のプールの初期の組成と比較しての相対的な豊かさと共にプールのトランスポゾン挿入サイトを識別する高スループット シーケンスによって分析されます。

このアプローチの主な利点は、同時に数匹の動物の突然変異体の数が多いを選別する能力です。Tn Seq は新しいレプトスピラを発見のチャンスを高めるトランスポゾン挿入サイトの事前の知識を必要としない-より少ない時間と効率と病原性に関与する特定の遺伝子。致命的な影響を受けやすい感染組織におけるレプトスピラ負担が比較的高いため齧歯動物のモデル (通常 10⁴ 10⁸細菌/g の組織に)^7,8,9同様貯水池ホスト^{のように10,11}, 文化、生体外で成長に伴うバイアスを軽減することがなく直接組織を分析できます。

Tn Seq 日付に記載されているほとんどの細菌性病原体の研究で挿入の高周波はまとめて持つすべての遺伝子^{4 内の複数の密接に間隔トランスポゾン挿入変異体を含む大規模なプールで感染を許可 ,12,13,14}。突然変異誘発頻度、程度の低い⁶細菌の Tn Seq も開発しました。レプトスピラとトランスポゾン変異体のライブラリは Slamtiら¹⁵のとおり活用によって子実プラスミド上のトランスポゾンを導入することで生成できます。しかし、 l. カバーのトランスポゾン誘発突然変異の頻度は低いです。受信者ごとの 10^-8 x のみ 8.5 l. カバー¹⁶ライ株細胞とになりそうです transconjugant 周波数が報告されたHimar1トランスポゾンが接合性プラスミドを導入された、L. カバーの他のほとんどの株と同様に悪い。ここで説明されているプロトコルに基づいてボレリアブルグドルフェリ、トランスポゾン挿入変異の頻度が低い⁶ではまたのために開発される部分です。

と共に、低ひずみでトランスポゾン挿入変異体を分離することで他のグループの成功のためにl ・ カバー型 Manilae ひずみ L495 とトランスポゾン変異を実施しましたプロトコル¹⁷パイロット実験LD₅₀ (致命的な線量) 病原性¹。Tn Seq による 42 変異体をスクリーニングし、いくつかの突然変異体候補候補アデニル酸シクラーゼ遺伝子の 2 つの挿入を含む病原性の欠陥を識別しました。ハムスターの 2 つの突然変異体の個々 のテスト彼らは病原性¹⁷の欠乏だったことを確認しました。