High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie

Identificatie van virulentiegenen voor sommige bacteriën, zoals Leptospira spp., is moeilijk vanwege het beperkte aantal genetische tools beschikbaar. Een veel gebruikte aanpak is het creëren van een collectie van mutanten door willekeurige transposon mutagenese, gevolgd door de identificatie van de site van de invoegpositie in elke mutant en virulentie testen van individuele transposon mutanten in een dierlijk model. Deze aanpak is tijdrovend, duur, en vereist een groot aantal dieren.

Wanneer willekeurige mutagenese werd voor het eerst ontwikkeld voor het pathogene agens Leptospira interrogans, werden genen die betrokken zijn in virulentie geïdentificeerd door het testen van afzonderlijke mutanten in een dierlijk model¹. Mutanten werden geselecteerd op basis van criteria zoals hun potentiële rol in de signalering beweeglijkheid of hun voorspelde buitenmembraan of oppervlakte locatie. Als de meerderheid van de leptospiral genen coderen hypothetische proteïnen van onbekende functie², selecteren mutanten op basis van deze criteria de mogelijkheid om te ontdekken van nieuwe leptospiral virulentiegenen.

Meer recentelijk, zwembaden van L. interrogans transposon mutanten waren gescreend voor infectiviteit in de hamster en muis modellen³. Elk dier werd aangevochten met een pool van maximaal 10 mutanten. Infectiviteit van een mutant werd gescoord als positief als het werd ontdekt door PCR van culturen verkregen uit bloed en de nieren. PCR testen was moeizaam, omdat het een individuele PCR reactie nodig voor elke mutant in het zwembad. Omdat de frequentie van elke mutant in de culturen was niet gekwantificeerd, was de aanpak bevooroordeeld naar identificatie van zeer verzwakte mutanten.

We beschrijven een transposon (Tn-Seq) techniek, als een strategie om efficiënter scherm voor virulentiegenen te rangschikken. TN-seq bestaat uit het creëren van een bibliotheek van mutanten door transposon mutagenese gevolgd door massale parallelle sequencing^4,5,6. Kort, transposon mutanten zijn gebundeld, geënt in dieren, en later teruggevonden uit verschillende organen (uitgang zwembaden). Het DNA van de zwembaden van de uitvoer is geëxtraheerd en verteerd met enzymen van de beperking of geschoren met het ultrasoonapparaat. Twee rondes van PCR gericht op de kruispunten van de transposon invoeging sites worden uitgevoerd. Deze stap kan de toevoeging van de adapters nodig voor de sequencing. De resulterende PCR producten worden geanalyseerd door hoge gegevensdoorvoer sequentiebepaling te identificeren van de site transposon invoeging van elke mutant van het zwembad samen met hun relatieve overvloed, die wordt vergeleken met de oorspronkelijke samenstelling van de pool van mutant.

Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid om gelijktijdig scherm een groot aantal mutanten met een klein aantal dieren. TN-Seq hoeft niet de voorkennis van de transposon invoeging sites die de kansen verhoogt van het ontdekken van nieuwe Leptospira-specifieke genen die betrokken zijn in virulentie met minder tijd en meer efficiëntie. Omdat leptospiral last in weefsels is relatief hoog in knaagdier modellen vatbaar voor dodelijke infectie (meestal 10⁴ tot 10⁸ bacteriën/g weefsel)^7,8,9 zo goed zoals in reservoir hosts ^10,11, weefsels kunnen rechtstreeks worden geanalyseerd zonder de behoefte aan cultuur, vermindering van vooroordelen als gevolg van in vitro groei.

In Tn-Seq studies met de meeste bacteriële pathogenen beschreven tot nu toe, de hoge frequentie van dat mutagenese toegestaan infectie met grote zwembaden met mutanten collectief hebben meerdere nauw-spaced transposon invoegingen binnen elk gen^{4 ,12,13,14}. TN-Seq heeft ook ontwikkeld voor een bacterie waarvoor de mutagenese frequentie veel lagere^{6 is}. Met Leptospira, kan een bibliotheek van transposon mutanten worden gegenereerd door de invoering van de transposon op een inzetbare plasmide door vervoeging zoals beschreven door Slamti et al.¹⁵. De frequentie van transposon mutagenese van L. interrogans is echter laag. Wanneer de Himar1 transposon werd geïntroduceerd op een conjugative plasmide, werd de frequentie van de transconjugant gemeld dat enige 8,5 x 10^-8 per ontvanger cel met de Lai stam van L. interrogans¹⁶ en dreigt te worden ook arme met de meeste andere stammen van L. interrogans. Het protocol hier beschreven is in deel op basis van die ontwikkeld voor Borrelia burgdorferi, waarin ook de frequentie van transposon dat mutagenese lage⁶.

Voor onze pilot experiment met het protocol¹⁷voerden we transposon mutagenese met L. interrogans serovar Manilae stam L495 vanwege het succes van andere groepen in het isoleren van transposon insertiemutanten in de stam samen met de lage LD₅₀ (letale dosis) voor virulentie¹. We 42 mutanten door Tn-Seq gescreend en verschillende mutant kandidaten defect in virulentie, waaronder twee met invoegingen in een kandidaat-adenylaat cyclase gen geïdentificeerd. Individuele testen van de twee mutanten in hamsters bevestigd dat zij tekort aan virulentie¹⁷waren.