Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

Identificación de genes de virulencia de algunas bacterias como Leptospira spp., es difícil debido al número limitado de herramientas genéticas disponibles. Un método comúnmente utilizado es la creación de una colección de mutantes por mutagénesis de transposon al azar seguido de la identificación del sitio de inserción en cada mutante y virulencia pruebas de mutantes de transposon individual en un modelo animal. Este enfoque es lento, costoso y requiere un gran número de animales.

Cuando mutagénesis al azar primero fue desarrollada para el patógeno Leptospira interrogans, genes implicados en virulencia fueron identificados por pruebas individuales mutantes en un modelo animal¹. Mutantes se seleccionaron con base en criterios tales como su papel potencial en la señalización o motilidad o su membrana externa prevista o ubicación superficial. Como la mayoría de leptoespiral genes codifican proteínas hipotéticas de función desconocida², selección de mutantes basan en estos límites de criterio la capacidad para descubrir genes de virulencia leptoespiral novela.

Más recientemente, revisaron las piscinas de mutantes de L. interrogans transposon de infectividad en los modelos de ratón y hámster³. Cada animal fue desafiada con una piscina de hasta 10 mutantes. Infectividad de un mutante lo marcó como positivo si fue detectado por PCR de cultivos obtenidos de sangre y los riñones. Pruebas de PCR fue laborioso, porque requiere una reacción de PCR individual para cada mutante en la piscina. Porque no se cuantificó la frecuencia de cada mutante en las culturas, el enfoque fue parcial hacia la identificación de mutantes altamente atenuadas.

Describimos un transposon secuencia técnica (Tn-Seq), como una estrategia para más eficientemente detectar genes de virulencia. TN-seq consiste en la creación de una biblioteca de mutantes por mutagénesis de transposon seguida de secuenciación masiva en paralelo^4,5,6. Brevemente, mutantes de transposon se agruparon inoculados en animales y más tarde recuperados de diferentes órganos (piscinas de salida). El ADN de las piscinas de salida es extraído y digerido con enzimas de restricción o esquilado por sonicación. Se realizan dos rondas de PCR a las uniones de los sitios de inserción de transposones. Este paso permite la adición de los adaptadores necesarios para la secuenciación. Los productos PCR obtenidos son analizados por secuenciación de alto rendimiento para identificar el sitio de inserción del transposón de cada mutante de la piscina junto con su abundancia relativa, que es comparado con la composición inicial de la piscina del mutante.

La principal ventaja de este enfoque es la capacidad de la pantalla al mismo tiempo un gran número de mutantes con un pequeño número de animales. TN-Seq no requiere el conocimiento previo de los sitios de inserción de transposones que aumenta las posibilidades de descubrir nuevas Leptospira-genes específicos implicados en virulencia con menos tiempo y mayor eficiencia. Porque carga leptoespiral en tejidos es relativamente alta en roedores modelos susceptibles a la letal infección (normalmente 10⁴ 10⁸ bacterias/g de tejido)^7,8,9 , así como anfitriones del depósito ^10,11, los tejidos pueden ser analizados directamente sin necesidad de cultivo, reduciendo sesgos debido al crecimiento en vitro .

En los estudios de Tn-Seq con mayoría patógenos bacterianos descritos hasta la fecha, la alta frecuencia de mutagénesis de insertional permite la infección con grandes piscinas que contengan a mutantes colectivamente con inserciones de transposones espaciamiento múltiples dentro de cada gen^{4 ,12,13,14}. TN-Seq también ha sido desarrollado para una bacteria para que la frecuencia de mutagénesis es mucho inferior⁶. Con Leptospira, una biblioteca de mutantes de transposon puede generarse introduciendo el transposon en un plásmido movilizable por la conjugación de Slamti et al¹⁵. Sin embargo, la frecuencia de mutagénesis de transposon de L. interrogans es baja. Cuando el transposon Himar1 fue introducido en un plásmido conjugativos, la frecuencia de transconjugant se informó que solamente 8.5 x 10^-8 por receptor de la célula con la cepa Lai de L. interrogans¹⁶ y es probable que del mismo modo pobre con más otras cepas de L. interrogans. El protocolo descrito aquí está en parte basado en que se convirtió para Borrelia burgdorferi, en el que la frecuencia de mutagénesis de insertional transposón es también baja⁶.

Para nuestro experimento piloto con el protocolo¹⁷, se realizó mutagénesis de transposon con L. interrogans serovar cepa Manilae L495 debido al éxito de otros grupos en el aislamiento de mutantes de inserción de transposones en la cepa junto con su bajo LD₅₀ (dosis letal) de virulencia¹. Se había defendido a 42 mutantes por Tn-Seq y se identificaron a varios candidatos mutantes defectuosos en virulencia, dos de ellos con inserciones en un gen de la adenilato ciclasa de candidato. Prueba individual de los dos mutantes en hámsteres confirmó que eran deficientes en virulencia¹⁷.