높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

Leptospira 종 등 일부 박테리아에 대 한 독성 유전자의 유전 도구 사용할 수 있는 제한 된 수 때문에 어렵습니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 각 돌연변이에 삽입 사이트의 식별 및 독성 테스트 동물 모델에서 개별 transposon 돌연변이의 임의의 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 컬렉션의 창조 이다. 이 방법은 소모, 비싼, 고 동물의 많은 수를 요구 한다.

무작위 mutagenesis Leptospira interrogans병원 체에 대 한 처음으로 개발, 유전자 독성에 관련 된 동물 모델¹에서 개별 돌연변이 테스트 하 여 확인 되었다. 돌연변이 신호에 그들의 잠재적인 역할 또는 운동 성 또는 그들의 예상된 외부 막 또는 표면 위치 같은 기준에 따라 선정 됐다. Leptospiral의 대부분으로 유전자 인코딩 알 수 없는 함수²의 가상 단백질, 선택 돌연변이 이러한 조건 제한에 따라 소설 leptospiral 독성 유전자를 발견 하는 능력.

더 최근에, L. interrogans transposon 돌연변이의 풀 infectivity 햄스터와 마우스 모델³에 대 한 상영 했다. 각 동물 수영장 최대 10 돌연변이에 전했다. 돌연변이의 infectivity 문화의 혈액과 신장에서 얻은 PCR에 의해 검색 된 경우 긍정적으로 득점 했다. 수영장에서 각 돌연변이 대 한 개별 PCR 반응 필요 하기 때문에 PCR 테스트 하는 것은 힘 드는. 문화에 각 돌연변이의 주파수는 계량 하지, 때문에 접근 했다 높은 감쇠 돌연변이의 id 쪽으로 치우친 다.

(테네시-Seq) 기법, 독성 유전자에 대 한 화면을 보다 효율적으로 하는 전략으로 시퀀싱 하는 transposon을 설명 합니다. 대규모 병렬 시퀀싱^4,,56다음 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 도서관의 창조 테네시-seq에 의하여 이루어져 있었다. 간단히, transposon 돌연변이 풀링된, 동물에 주사 고 나중 다른 장기 (출력 풀)에서 복구. 출력 풀에서 DNA 추출 및 금지 효소로 소화 또는 쥡니다에 의해 전단. 2 라운드 PCR transposon 삽입 사이트의 접속을 대상으로 수행 됩니다. 이 단계는 시퀀싱에 필요한 어댑터의 추가 수 있습니다. 결과 PCR 제품의 그들의 관계 되는 풍부, 돌연변이의 수영장의 초기 구성에 비해 함께 수영장의 각 돌연변이 transposon 삽입 사이트를 식별 하려면 높은 처리량 연속 분석 된다.

이 방법의 주요 장점은 많은 동물의 작은 수로 돌연변이 동시에 화면을 기능입니다. 테네시-Seq 새로운 Leptospira발견의 기회를 증가 하는 transposon 삽입 사이트의 사전 지식이 필요 하지 않습니다-특정 유전자 독성에 더 적은 시간 및 더 큰 효율성과 관련된. 설치류 모델에 치명적인 감염 감염 조직에 leptospiral 부담에서 상대적으로 높기 때문에 (일반적으로 10⁴ 조직의 10⁸ 박테리아/g)^7,,89 또한 저수지 호스트 ^{에서 10,11}, 조직 문화, 생체 외에서 성장으로 인해 편견을 줄일 필요 없이 직접 분석 될 수 있다.

테네시-Seq 날짜를 설명 하는 대부분 세균성 병원 체 연구, insertional mutagenesis의 높은 주파수 통칭 데 모든 유전자^{4 내 여러 긴밀 한-간격 transposon 삽입 돌연변이 포함 하는 큰 풀과 감염을 허용 ,12,,1314}. 또한 테네시-Seq는 mutagenesis 주파수는 훨씬 낮은⁶박테리아에 대 한 개발 되었습니다. Leptospira, 함께 transposon 돌연변이의 라이브러리 활용 설명 된 대로 Slamti 외¹⁵여 의해 transposon mobilizable 플라스 미드에 도입 하 여 생성할 수 있습니다. 그러나, L. interrogans 의 transposon mutagenesis의 주파수가 낮습니다. Transconjugant 주파수만 8.5 받는 당 10^-8 x L. interrogans¹⁶ 라이 긴장으로 세포와 될 것입니다 알려졌다 Himar1 transposon conjugative 플라스 미드에 도입 되었다, L. interrogans의 대부분 다른 종자와 마찬가지로 가난한 사람 여기에 설명 된 프로토콜 보렐 리아 burgdorferi는 transposon insertional mutagenesis의 주파수는 또한 낮은⁶에 대 한 개발에 기반 하는 부분 이다.

프로토콜¹⁷우리의 파일럿 실험에 대 한 낮은 함께 피로 transposon 삽입 돌연변이 고립 시키는에 다른 그룹의 성공 때문에 L. interrogans serovar Manilae 긴장 L495와 transposon mutagenesis 실시 LD₅₀ (치명적인 복용량) 독성¹. 우리 테네시-Seq에 의해 42 돌연변이 검사 하 고 여러 돌연변이 후보 후보 adenylate 있고 유전자에서 2 삽입을 포함 한 독성에 결함을 발견. 햄스터에 두 돌연변이의 개별 테스트 그들이 결핍 독성¹⁷에 확인.