Высок объём параллельного секвенирования для измерения фитнес Лептоспире interrogans Transposon вставки мутантов во время Золотой сирийского хомяка инфекции

Идентификация генов вирулентности для некоторых бактерий, таких как Leptospira spp., затруднено из-за ограниченного числа генетических инструментов, доступных. Один из часто используемых подходов является создание коллекции мутантов, случайных transposon мутагенеза, следуют идентификации включение сайта в каждом мутант и вирулентности тестирование отдельных transposon мутантов в животной модели. Этот подход является длительным, дорогостоящим и требует большое количество животных.

При случайных мутагенеза была впервые разработана для патогена Лептоспире interrogans, генов, участвующих в вирулентности были определены путем тестирования отдельных мутантов в животной модели¹. Мутанты были отобраны на основе таких критериев, как их потенциальной роли в сигнализации подвижности или их предсказал внешней мембраны или поверхности местоположение. Как и большинство leptospiral гены кодируют гипотетических белки неизвестной функции², выбрав мутантов основанный на эти критерии ограничения возможность обнаружения генов вирулентности Роман leptospiral.

Совсем недавно бассейны л interrogans transposon мутантов были экранированы для инфективности в хомяк и мыши модели³. Каждое животное было оспорено с бассейном до 10 мутантов. Инфективности мутант был забит как положительным, если он был обнаружен методом ПЦР культур, полученных из крови и почек. PCR тестирования был трудоемким, потому что он требует индивидуальной реакции PCR для каждого мутант в бассейне. Потому что частота каждого мутант в культурах количественно не оценивалась, подход был предвзято к идентификации весьма ослабленный мутантов.

Мы описываем transposon виртуализации (Tn-Seq) технику, как стратегия более эффективно экран для генов вирулентности. TN-seq состоит из создания библиотеки мутантов transposon мутагенеза, следуют массивной параллельной последовательности^4,5,6. Кратко transposon мутантов пуле, привитых животных и впоследствии оправился от различных органов (вывода бассейны). ДНК из пулов вывода извлечены и переваривается с энзимами ограничения или стриженый sonication. Два раунда ПЦР ориентации развязок transposon вставки сайтов выполняются. Этот шаг позволяет адаптеров, необходимые для последовательности. Результате продукты PCR анализируются высокопроизводительного секвенирования для выявления transposon вставки сайт каждого мутант бассейна наряду с их относительного изобилия, который сравнивается с первоначальный состав пула мутант.

Основным преимуществом этого подхода является возможность одновременно экран большое количество мутантов с небольшое количество животных. TN-Seq не требует предварительных знаний о transposon вставки сайты, что увеличивает шансы выявления новых Leptospira-специфических генов, участвующих в вирулентности с меньше времени и повышения эффективности. Поскольку бремя leptospiral в тканях является относительно высоким в грызун модели восприимчивы к смертельной инфекции (обычно 10⁴ 10⁸ бактерий/g ткани)^7,8,9 , также как и хозяева водохранилище ^10,11, тканей могут быть проанализированы непосредственно, без необходимости культуры, снижения отклонений вследствие роста в пробирке .

В большинство бактериальных патогенов, описанные на сегодняшний день исследований, Tn-Seq высокая частота инсерционному мутагенезу допускается инфекции с большими бассейнами, содержащие мутантов вместе с нескольких близко расположенных transposon вставок в каждый ген^{4 ,12,,1314}. TN-Seq была также разработана для бактерий, для которого мутагенеза частота является намного ниже⁶. С Leptospiraбиблиотека transposon мутантов могут создаваться путем введения transposon на мобилизационный плазмиды путем конъюгации, как описано в Slamti et al¹⁵. Однако частота transposon мутагенеза л interrogans является низким. Когда Himar1 transposon была введена на сопряженных плазмида, частота transconjugant сообщается только 8,5 x 10^-8 для каждого получателя ячейки с Лай штамм L. interrogans¹⁶ и, вероятно, будет Аналогичным образом бедных с большинства других штаммов L. interrogans. В части, на основе, которая разработана для Borrelia burgdorferi, в котором частота transposon инсерционному мутагенезу является также низкая⁶протокол, описанных здесь.

Для нашего эксперимента с протоколом¹⁷мы провели transposon мутагенеза с л interrogans серовар штамм Manilae L495 из-за успеха других групп в Изолирующие вставки мутантов transposon в штамм наряду с его низкой LD₅₀ (летальная доза) для вирулентности¹. Мы экранированный 42 мутантов, Tn-Seq и определили несколько мутантов кандидатов дефектных в вирулентности, включая два с вставками в гене Аденилатциклаза кандидата. Индивидуальные испытания двух мутантов в хомяков подтвердил, что они являются несовершенными в вирулентности¹⁷.