アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法
Summary
このプロトコルでは、電気泳動、ゲル画像を用いた近赤外蛍光に分類された DNA に変化の観察を通じて変更された DNA の DNA ポリメラーゼの合成の特性について説明します。アクリルアミドゲルはサイズに応じて異なる速度で移行短い核酸の分離の高分解能イメージングに使用されます。
Abstract
酵素、堅牢な定量的メソッドがネイティブと組み換え酵素の特性評価のため必要です。DNA ポリメラーゼの DNA 合成は、体外DNA 合成法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動が続くと言えます。この試金の目標は、変更された DNA (DNA) と自然な DNA の合成を定量化することです。これらのアプローチは単一のヌクレオチド分解能、酵素オリゴヌクレオチド合成時の個々 のステップの観察とオリゴヌクレオチドを解決する場合に特に便利です。これらのメソッドは、DNA 合成の個々 のステップ、DNA 合成と DNA 結合親和性の誤り率の定常状態速度定数の測定などの生化学的および生物物理学的プロパティの配列の評価に適用されています。使用して、変更されたヌクレオシドの三リン酸塩に限らず、(NTP) は、M-DNA および/または突然変異 DNA のポリメラーゼ、ペアを効果的に評価できる基板 DNA ポリメラーゼの相対的なユーティリティを含むコンポーネントを変更しました。ここでは、我々 は非伝統的なプライマー DNA の分類の近赤外蛍光標識 DNA などの戦略に合わせて行う必要があります変更を含め、自身を分析を詳しく説明します。また、注ぐアクリルアミドゲルの重要な技術的なステップの詳細な実行して、することがあります技術的に挑戦的です。
Introduction
DNA ポリメラーゼは、正確かつ効率的な DNA 合成を行い、ゲノムの整合性の維持に不可欠な。エラーすることがなく何百もの 1 秒あたりのヌクレオチドを合成する能力も分子生物学とバイオ テクノロジーの DNA ポリメラーゼの不可欠なツールになります。ただし、これらのプロパティも M DNA 基板上へのアプリケーションを制限します。一般的に言えば、自然の DNA ポリメラーゼを合成できない多くの可能性のある貴重な DNA の M 基板可能性が高いため生体内で非標準基板の使用に対する高選択的圧力に。多くのグループが進化の M DNA 合成1,2,3,4、5のことができる突然変異の DNA ポリメラーゼを生成する方法を開発しています。これらの努力は、DNA6,7,8のバイオ テクノロジーの有用性を拡大しています。
M-DNA を合成する DNA ポリメラーゼの変異体の能力を評価する私たち9,10, その他11,12,13通常使用 DNA の生体外の測定本稿で説明するポリメラーゼ活性。これらの実験で DNA ポリメラーゼが二重標識プライマー/テンプレートとヌクレオシド三リン酸基板; 共同培養製品は、ゲルの電気泳動によって評価されます。実験の具体的な質問、突然変異の DNA ポリメラーゼ、変更されたプライマー、によって修正されたテンプレートまたは変更されたヌクレオシドの三リン酸塩使用できます、変異体酵素活動の体系的な生化学的評価を有効にします。
歴史的には、これらの試金は DNA 合成; を追跡する 5′ 放射性ラベルに頼ってきた最も一般的に、 32P、 33P が使用されています。通常、ラベル付けには、T4 ポリヌクレオチド キナーゼ11を使用して実現されます。ただし、有限の存続期間、放射性ラベル及びその安全な処分のコストが比較的高いため当社グループは代わりに分類される DNA 合成 5′ 近赤外蛍光を使用します。比較的低コストの近赤外ゲルの撮像素子を使用して、同様の検出限界放射性ラベル (未発表結果) を使用して事前研究を観察しています。過去の観測9、正常に再現しております、我々 はない前に測定した速度定数 (結果は未発表) で大規模な定量的な違いを観察しています。
DNA のサイズとしたがって、DNA 合成の範囲を分析するには、我々 はサンガー シーケンス14キャピラリー電気泳動15の出現の前に、のもともと開発されたポリアクリルアミドゲルの電気泳動方法に依存します。分離や移動の距離は、分子量の測定として使用できます。大判、ポリアクリルアミドゲル垂直は単一のヌクレオチド分解能、さまざまな長さのオリゴヌクレオチドを DNA の定量的観測を実現できます。
総称して、これらの実験は、ポリメラーゼ特性に対する堅牢な方法です。時間のため反応、準備とケアの敏感な性質は再現性のある結果を達成するために必要です。さらに、アクリルアミド ゲル多数 DNA 変更、他の反応単一ヌクレオチド分解能でと同様、DNA 合成を測定する非常に効果的な方法ですが、技術的に困難な場合ができます。ここのプロトコルがうまくいけば、ユーザーは最も一般的なミスを回避しながらこれらの実験を実行するを有効にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、DNA ポリメラーゼを介した DNA の合成を特徴付けるアッセイを説明しました。近赤外線標識 DNA プライマーを使用し変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、異なるサイズのオリゴヌクレオチドを解決する、我々 は合成の正確な測定を有効にするオリゴヌクレオチドの単一のヌクレオチドの解像度を取得できます。これらのアプローチは、酵素 (セクション 2.1) の全体の活?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事はだった科学の進歩 (コットレル大学学者賞 #22548) の研究株式会社トライリンク バイオ (ResearchReward グラント #G139) でサポートされています。
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Riferimenti
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